MODS의 결핵의 진단 방법과 내성 결핵을 multidrug

전 세계 인구 3명 중 1명이 결핵에 감염되어 있습니다. 활동성 결핵을 진단하는 것은 새로운 감염을 방지하는 길입니다. 활동성 결핵 환자는 치료를 받거나 사망할 때까지 연간 10명에서 15명의 다른 사람들을 감염시키기 때문입니다. MODS는 현미경 관찰(microscopic observation), 약물 감수성 검사(drug susceptibility assay)의 약어로, 왜 그렇게 불리는지는 방법론에 대한 설명과 함께 명확해질 것입니다.

짧은 영상을 통해 결핵 및 다제내성 결핵의 신속하고 저렴한 진단을 위한 mods 방법론의 개요를 설명하겠습니다. 영상에서는 방법론을 단계별로 제시할 것입니다. 액체 배양 작업 시의 생물안전 영향에 대해 논의하고, 이 방법론을 사용하는 데 필요한 몇 가지 중요한 품질 보증 문제에 대해서도 설명하겠습니다.

mods 분석법은 페루 리마에 위치한 Kayana University의 Bob Gilman 연구실에서 개발되었습니다. 이는 loose cavi의 초기 관찰 결과에 따른 것입니다. LOOSE는 색도 지시약을 사용하여 배양액 내의 mycobacterium tuberculosis를 빠르게 검출하는 방법을 찾고자 했습니다.

하지만 그녀는 현미경으로 해당 배양물을 관찰한 결과, 비색 지시약의 색이 변하기 며칠 전부터 미세 세균의 성장이 관찰되었다는 점에 주목했으며, MOD 분석법은 바로 이러한 관찰을 바탕으로 개발되었습니다. MOD 분석법은 자원이 제한된 환경에서 개발되었으며 해당 환경을 대상으로 하므로, 액체 배양 기반의 TB 검출 및 다제내성 검출 비용이 테스트당 3달러 미만입니다. 이는 매우 매력적이며, 자원이 제한된 지역에 이러한 진단 능력을 최초로 제공하게 됩니다.

따라서 MODS 분석은 세 가지 핵심 원리를 기반으로 합니다. 첫 번째는 mycobacterium tuberculosis가 고체 배지보다 액체 배지에서 훨씬 더 빠르게 성장한다는 점입니다. 이는 이미 수년 전부터 알려진 사실입니다.

둘째로, 이러한 액체 배지를 현미경으로 관찰하면 고체 배지에서 콜로니가 거시적으로 나타날 때까지 기다리는 것보다 훨씬 더 빠르게 결핵균(M. tuberculosis)의 성장을 검출할 수 있습니다. 실제로 이러한 성장은 매우 특징적이어서, 액체 배지 내의 M. tuberculosis를 다른 세균이나 진균 오염, 또는 존재할 수 있는 비정형 비결핵 항산균의 성장과 구별할 수 있습니다. 마지막으로, 아마도 MGIT 검사의 가장 흥미로운 점은 리팜피신과 같은 약물을 첨가하여 가래(sputum)로부터 직접 다제내성 여부를 확인할 수 있다는 것입니다.

분석 시작 단계에서 해당 약물들을 사용함으로써, 결핵균 검출과 동시에 분리주가 이 두 가지 약물에 내성이 있는지 여부를 확인할 수 있습니다. 이는 계대 배양을 통해 간접 약물 감수성 시험을 수행해야 하는 필요성을 없애 줍니다. 이제 MODS 분석을 수행하는 데 필요한 장비들에 대해 설명하겠습니다.

조제된 배지를 보관하기 위해 냉장고가 필요합니다. 시약과 Rifampin의 무게를 측정하기 위해 저울이 필요합니다. 객담을 혼합하기 위해 볼텍스 믹서가 필요합니다.

제염 용액을 사용하여 제염된 객담 시료를 농축하려면 원심분리기가 필요하며, 이는 3000 G에 도달할 수 있어야 합니다. 원심분리기에 냉장 기능이 있을 필요는 없으나, 생물학적 안전성(bios safe)이 확보되어야 한다는 점이 매우 중요합니다. 마이코박테리아 관련 작업의 경우 원심분리기 버킷을 잠금 가능한 뚜껑으로 밀봉할 수 있어야 합니다. 또한 37°C에 도달하고 이를 유지할 수 있는 배양기가 필요합니다.

CO2 농축은 필요하지 않습니다. mods 플레이트를 판독하기 위해 도립 현미경이 필요하며, 이는 4x 및 10x 대물렌즈를 갖추어야 합니다. 배지 멸균 및 미생물 배양물 폐기를 위해 오토클레이브가 필요하며, 배지 분주를 위한 마이크로 파이펫과 생물 안전 작업대가 필요합니다. 객담 시료 조작 및 플레이트 접종 과정에는 2등급 생물 안전 작업대가 필요합니다.

mods 분석을 수행하는 데 필요한 시약은 다음과 같습니다. Middlebrook 7H9 배지, 항생제 보충제인 glycerol Panta 및 OADC, 그리고 항생제 영양 보충제 스톡인 Rifampin, rifampicin 조제를 위한 dimethyl sulfoxide (DMSO), 가래 오염 제거를 위한 sodium hydroxide, sodium citrate 및 nyl cysteine, 인산염 완충액 조제를 위한 di sodium phosphate 및 mono potassium phosphate, 감염성 폐기물 처리를 위한 10% sodium hypochlorite 및 작업 표면 세척용 소독제입니다. 또한 다음과 같은 플라스틱 및 소모품이 필요합니다. 멸균 유리 튜브, 수성 용매용 0.2 µm 필터 및 유기 용매용 0.2 µm 필터, 마이크로 원심분리 튜브, 15 mL 원심분리 튜브, 멸균 50 mL 및 10 mL 세롤로지컬 피펫, 멸균 마이크로피펫 팁, 24웰 조직 배양 플레이트, 그리고 가래 샘플을 배지에 접종한 후 24웰 플레이트를 넣을 수 있는 밀봉 가능한 Ziploc 타입의 비닐 백입니다.

미리 준비할 수 있는 스톡 용액은 총 네 가지 그룹이 있습니다. 인산염 완충액은 pH 6.8 ± 0.2로 조정된 인산나트륨 이염기성 용액과 인산칼륨 일염기성 용액의 조합으로 제조합니다. 이 용액은 멸균을 위해 121~124°C에서 15분간 오토클레이브 처리하며, 분주액을 영양 배지에 배양하여 멸균 여부를 확인합니다.

이는 2~8°C의 냉장고에 최대 한 달 동안 보관할 수 있습니다. 각 객담 샘플에는 10 mL의 인산 완충 용액이 필요합니다. 객담 오염 제거를 위한 스탁 용액은 수산화나트륨과 시트르산나트륨의 혼합물입니다.

이 용액들을 동일한 부피로 혼합하여 121~124°C에서 15분 동안 고압증기멸균하며, 2~8°C의 냉장고에 최대 한 달 동안 보관할 수 있습니다. 각 객담 검체당 이 용액 2mL가 필요합니다. 기본 배양 배지는 cascione과 glycerol이 첨가된 Middlebrook 7H9로 구성됩니다.

7H9 분말을 글리세롤과 카세인 하이드로네이트가 함유된 멸균 증류수에 용해시키고, 완전히 녹을 때까지 지속적으로 교반하며 혼합합니다. 이 배지를 121~124 °C에서 15분 동안 고압 증기 멸균한 후, 냉각시켜 멸균된 16 x 100 mm 유리 시험관에 4.5 mL씩 분주합니다. 배지를 37 °C에서 48시간 동안 배양하여 멸균 여부를 확인하며, 이 시간이 지난 후 탁도가 없으면 멸균된 것으로 판단합니다. 캡을 단단히 닫아 2~8 °C에서 최대 한 달 동안 보관할 수 있습니다.

각 가래 샘플에는 이 배양액 4.5 milliliters가 들어 있는 튜브 하나가 필요합니다. 배지 항생제 스탁 용액은 다음과 같이 준비합니다. 멸균 증류수에 완전히 녹인 후, 수성 용매용 0.2 micrometer 시린지 필터로 여과합니다. 이후 20 microliter씩 분주하여 멸균 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 -20 degrees centigrade에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있으며, 20 microliter 분주액 하나로 최대 100개의 샘플을 처리하기에 충분합니다.

리팜핀(Rifampin) 스톡 용액(8 mg/mL)은 rifampicin을 DMSO와 멸균 증류수에 녹여 준비합니다. 이 혼합물은 유기 용매용 0.2 µm 시린지 필터로 여과하며, 용액은 멸균 마이크로 원심분리 튜브에 20 µL씩 소분하여 -20 °C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다. 20 µL 소분액 하나로 최대 100개의 샘플을 처리하기에 충분합니다. 이제 방법론 자체와 실험 당일에 수행해야 할 세 가지 단계에 대해 알아보겠습니다.

이 과정은 스톡 용액을 작업 용액으로 변환하는 단계입니다. 먼저 오염 제거 용액을 준비하고, 그다음 배지 용액을 준비합니다. 마지막으로 약물인 isen 및 Rifampin의 작업 용액을 준비합니다.

mods 방법론에 사용되는 오염 제거 방법은 표준화된 수산화나트륨 nalk 오염 제거 방법론입니다. nalk는 점액 용해제로, 객담의 소화를 도와 수산화나트륨이 오염 제거를 수행할 수 있게 합니다. 이를 위해 수산화나트륨 시트르산나트륨 스톡 용액이 필요하며, 해당 용액 20 ml에 NA 0.1 g을 첨가합니다.

조제 당일에 사용하지 않은 모든 용액은 폐기해야 합니다. 배지의 최종 조제 또한 사용 당일에만 수행해야 합니다. 보관된 seven H nine 배지를 OADC 및 panta와 혼합합니다. 각 튜브에 배지 4.5 mL, OADC 0.5 mL, Panta 0.1 mL를 혼합합니다.

이는 샘플 1개에 충분한 양입니다. 각 약물의 작동 용액은 사용 당일에 조제하며, 활성이 보장되지 않으므로 사용하지 않은 용액은 폐기해야 합니다. 보관된 분주액을 media 7H9 OADC가 담긴 24웰 조직 배양 플레이트에 연속 희석하여, 가래 샘플과 배지를 추가한 후 최종 웰 농도가 보리코산(boric acid) 0.4 µg/mL, 리팜핀(Rifampin) 1 µg/mL이 되도록 합니다.

이제 오염 제거 절차로 넘어가겠습니다. 2 mL의 객담 샘플을 원뿔형 바닥의 Falcon 튜브에 넣고, 수산화나트륨 우유 오염 제거 용액 2 mL를 추가합니다. 뚜껑을 닫고 단단히 조인 후, 현탁액을 볼텍싱하고 15분 동안 그대로 두어 오염 제거 과정이 진행되도록 합니다. 이 시간이 지난 후, 14 mL의 인산염 완충 용액을 추가합니다.

뚜껑을 닫고 단단히 조인 후, 튜브를 원심분리기에 넣고 3000 G에서 50분간 원심분리합니다. 상층액을 따라내고 남은 펠릿이 우리가 7H9 OEDC 배지가 담긴 5.1 mL 튜브를 사용하여 도말하고자 하는 샘플입니다. 펠릿을 약 2 mL 부피가 되도록 재현탁합니다. 재현탁된 샘플의 절반은 백업용으로 마이크로 원심분리 튜브에 보관합니다.

이는 배양액이 오염되어 샘플을 다시 도말해야 하는 경우를 대비해 준비하는 것입니다. 나머지 1mL는 유리 튜브에 들어 있는 나머지 7mL의 H₂O 및 DC panter에 추가하며, 이렇게 하여 도말 준비가 된 샘플이 완성됩니다. 이 배지 및 샘플 현탁액 900µL를 24웰 플레이트의 한 컬럼 내 4개 웰에 각각 분주합니다.

24-웰 플레이트의 나머지 웰에는 이후 샘플들을 채웁니다. 5개의 열에 각각 하나씩 총 5개의 샘플을 채우고, 6번째 열은 샘플 없이 비워둡니다. 6번째 열은 음성 대조군으로 활용됩니다. 이 열에는 가래 샘플을 제외한 모든 배지 성분을 넣으며, 이 열에서 성장이 관찰되면 교차 오염 문제가 발생한 것이므로 플레이트 전체를 폐기해야 합니다.

실행하는 모든 플레이트에는 음성 대조군 컬럼이 필요합니다. 이제 모든 샘플과 배지가 포함된 플레이트가 준비되었습니다. 항생제 현탁액은 별도의 플레이트에 추가해야 합니다.

이전에 설명한 방식대로 Rifampin과 Isid의 희석액을 준비하였으며, 4채널 멀티 파이펫을 사용하여 각 웰에서 100 µL씩 수집합니다. 그리고 두 개의 대조군 웰에 각각 100 µL의 7H9 OADC를 분주하고, 두 개의 약물 함유 웰에 각각 100 µL의 Rifampin과 100 µL의 Isid를 분주합니다. 플레이트 작성이 완료되면 덮개를 닫고 지플락 백 안에 넣습니다. 이 시점 이후로는 백을 다시 열지 않으므로, 액체 배지에서 성장하는 모든 배양물은 백 외부로 유출될 가능성이 없습니다.

이제부터 플레이트의 모든 판독은 백 내부에서 수행하며, 해당 백은 오토클레이브 백에 넣어 배양 종료 후 폐기합니다. 이러한 방식을 통해 고농도의 마이코박테리아 현탁액을 직접 다루는 것을 방지합니다. 이제 품질 관리에 대해 몇 가지 말씀드리겠습니다.

mods 방법론에는 분석의 적절한 사용을 위해 필수적인 내장 품질 관리 항목이 포함되어 있습니다. 우선, 모든 플레이트마다 음성 대조군을 실행합니다. 앞서 언급되었지만, 요약하자면 플레이트상에 5개의 가래 샘플과 함께 가래 샘플 없이 모든 배지 성분만 포함된 컬럼을 둡니다. 해당 컬럼의 웰들은 다른 웰들과 동일하게 검사해야 하며, 이 웰들에서 성장이 관찰되면 교차 오염이 발생했음을 나타내므로 해당 플레이트의 어떤 결과도 신뢰할 수 없습니다.

따라서 해당 플레이트는 폐기해야 하며 모든 샘플을 다시 플레이팅해야 합니다. 또한, 양성 대조군 역할을 하는 내부 대조군이 있습니다. 이는 별도의 플레이트에서 진행하며, 실험실 내 교차 오염의 위험을 최소화하기 위해 하루 일과 끝에 다른 모든 샘플 플레이트의 준비가 완료된 후 이 플레이트를 준비합니다.

이 별도의 플레이트에서는 완전히 감수성이 있는 mycobacterium tuberculosis 균주 하나와 isid 및 rifampicin에 내성이 있는 균주 하나를 배양합니다. 플레이트에서 다제내성 균주를 배양하는 것이 우려되는 경우, 이 두 가지 감수성 및 MDR 균주 대신 rifampin 단독 내성 균주와 is 단독 내성 균주를 배양할 수 있습니다. 이러한 균주를 사용하는 목적은 배지가 성장을 지원한다는 것을 입증하는 것(따라서 모든 양성 대조군은 약물이 없는 배지에서 성장해야 함)뿐만 아니라, 약물 농도가 정확하다는 것을 확인하기 위함입니다. 따라서 감수성 양성 대조군은 is 및 Rifampin이 존재하는 환경에서 성장해서는 안 되며, 내성 양성 대조군은 당연히 플레이트에 포함된 Rifampin 및 is 농도에서도 성장해야 합니다.

이제 플레이트 판독 단계로 넘어가겠습니다. 샘플을 분주한 날을 0일째라고 했을 때, 5일째부터 플레이트 판독을 시작합니다. 그 이전에는 마이코박테리아의 성장이 매우 드물게 관찰됩니다.

플레이트를 도립 광학 현미경으로 관찰합니다. 즉, 플레이트를 아래에서 위로 관찰하며, 이를 통해 코드(cords)를 매우 명확하게 확인할 수 있습니다. 플레이트 덮개의 응결수로 인해 위에서 배양물을 시각화하려는 시도는 제한되며, 또한 일반적인 현미경의 초점 거리가 적절하지 않기 때문입니다. 현미경 관찰은 일반적으로 10배 대물렌즈로 수행하며, 약물이 없는 두 웰 모두에서 적어도 2개의 콜로니 형성 단위(colony forming units)가 관찰되는 경우를 양성 배양으로 간주합니다.

배지가 혼탁해지고 5일째가 되면 일반적으로 웰의 대부분에 과성장이 일어나므로 오염 여부를 쉽게 확인할 수 있습니다. 반면, 마이코박테리아(mycobacterial) 증식은 웰의 혼탁함을 유발하지 않으며, 초기 증식 시 마이코박테리아는 작은 쉼표 모양을 형성하고 점차 특징적인 코드(chord)나 엉킴 형태로 진행됩니다. 2주 이내에 강양성 증식이 나타나면 마이코박테리아 응집체가 형성되며, 코드는 주로 가장자리 부분에서만 관찰됩니다.

양성으로 전환될 대부분의 배양물은 14일 차까지 양성 반응을 보입니다. 따라서 5일 차부터 14일 차까지는 매일 판독하고, 그 이후에는 실험실의 업무량에 따라 2~3일마다 판독하는 것을 권장합니다. 두 개의 약물 비첨가 웰(drug-free wells)에서 배양물이 명확하게 양성으로 확인된 날에 약물 첨가 웰을 판독해야 합니다. 두 약물 중 어느 하나라도 존재하는 상태에서 성장이 관찰되면 해당 약물에 대한 내성을 나타냅니다. 약물 비첨가 웰에서 양성 배양물이 확인된 후 1주일이 지난 뒤에 약물 첨가 웰 영역을 판독하는 경우, 간헐적인 돌파 성장(breakthrough growth)이 관찰될 수 있으므로 이것이 반드시 내성을 의미하는 것은 아님을 유의하는 것이 매우 중요합니다.

배양 결과가 음성인 경우 21일째에 판독을 중단할 수 있는데, 이는 치료를 받지 않는 환자에게서 이 시점 이후에 양성 배양 결과가 나타나는 사례가 없기 때문입니다. 21일간의 배양이 완료되면 배양물을 폐기할 수 있습니다. 배양물은 지플락(Ziploc) 백에 담긴 상태로 오토클레이브 백에 넣어 121~124 °C에서 45~60분 동안 멸균한 후 안전하게 폐기하십시오. 이제 페루뿐만 아니라 아프리카와 아시아 지역에서도 MODS 분석법을 도입해 온 만큼, 생물 안전성과 MODS 분석법에 대해 몇 가지 말씀을 드리겠습니다.

액체 배지를 이용한 마이크로박테리아 배양의 안전성 및 생물 안전성에 대해 반복적으로 의문이 제기됩니다. 액체는 당연히 쏟아질 수 있는 반면 고체 배지는 그러한 위험이 없으며, 마이크로박테리아 현탁액을 다룰 때 에어로졸화될 위험이 있다는 점에서 이는 충분히 이해할 수 있는 우려입니다. 사실 이러한 이유들 때문에 우리는 MOD 방법론이 간접 약물 감수성 테스트를 필요로 하는 그 어떤 방법론보다 더 안전한 방법론이라고 믿습니다.

그 이유는 간접 감수성 시험의 경우, 기지 농도의 미생물 현탁액을 준비해야 하기 때문입니다. 따라서 이는 고농도의 미생물 용액을 다루는 과정이 수반되며, 이 과정에서 용액의 유출 및 에어로졸 발생과 같은 모든 수반 위험이 존재합니다. 이와 대조적으로, 이제 확인하셨듯이 mods 방법론은 단순히 가래 검체를 플레이트에 접종한 후, 플레이트를 플라스틱 백으로 밀봉하는 과정만으로 이루어집니다.

이 백은 다시는 열지 않으므로, 고농도 현탁액을 직접 다룰 필요가 없습니다. 그렇다고 해서 이 방법(mod methodology)이 완전히 안전하다고 믿는 것은 아니며, 마이코박테리아(mycobacteria)를 취급하는 것은 언제나 위험이 따릅니다. 하지만 2006년에 발표된 한국의 데이터는 mods 방식이 다른 배양물을 도말하는 것보다 더 위험하지 않다는 우리의 입장을 뒷받침하는 것으로 보입니다.

이는 실험실 종사자를 대상으로 수행된 연구로, 배양물을 도말하는 작업을 수행하되 약제 감수성 시험 책임이 없는 실험실 종사자의 직업적 위험도가 객담 도말 현미경 검사를 수행하는 이들의 위험도보다 높지 않음을 보여주었습니다. 반면, 마이코박테리아 현탁액을 다루고 약제 감수성 시험을 수행하는 이들은 결핵에 대한 직업적 위험률이 훨씬 더 높습니다. 따라서 모든 실험실 직원을 가능한 한 최대한 보호하는 것이 매우 중요하며, 이에 따라 N95 표준 마스크로 대표되는 적절한 개인 호흡기 보호구 없이 이러한 절차를 수행하지 않을 것을 강력히 권고합니다.

또한, 모든 배기 구역이 HEPA 필터로 여과되는 2급 생물안전작업대 또는 후드가 필요합니다. 마지막으로, 실험실 내 기류의 와류를 방지하는 데 매우 중요한 간단한 장치는 샘플 처리 중에 인원이 출입하지 못하도록 실험실 문을 잠그는 것입니다. 이는 실험실 내 전파 위험을 줄여줍니다. 따라서 지금까지 설명드린 내용이 MODS 방법론이 무엇인지, 그리고 자원이 제한적이지만 고품질의 TB 및 MDR TB 진단이 시급히 필요한 환경에서 이 방법이 얼마나 유용할 수 있는지에 대해 충분한 개요가 되었기를 바랍니다.

더 자세한 내용은 저희 웹사이트인 mods peru. org를 방문하시기 바랍니다. 이곳에서 상세한 표준 작업 절차서와 mods 사용자 가이드를 확인하실 수 있습니다. 폐 외 검체 처리 절차에 관한 SOP 외에도, mycobacterium 및 tuberculosis, 기타 mycobacteria 및 세균·진균 오염의 사진 라이브러리를 제공하고 있으며, 저희의 품질 보증 전략과 mods 사용을 시작하기 위해 권장되는 실험실 인증 절차 또한 확인하실 수 있습니다.

마지막으로, 자주 묻는 질문(FAQ) 시트가 준비되어 있으며, 본 방법론은 반복적인 개선 과정을 거치므로 현재 mods를 사용 중인 사용자분들의 모든 피드백을 환영합니다. 앞서 설명드렸듯이, 이는 비독점적인 테스트이며 다른 연구실에서 달성한 개선 사항에 대해 항상 관심을 가지고 있습니다.