Directe Start van een replicatievork vast door een Head-On RNA polymerase

Het algemene doel van deze procedure is om het lot van de Repli-zone en RNA-polymerase of RNAP te observeren na een frontale botsing. Dit wordt bereikt door eerst het transcriptiecomplex te assembleren op gebiotineerd DNA en dit te immobiliseren op Stripp-tabletten en beads, wat zal resulteren in het gestopte RNAP-elongatiecomplex. De tweede stap van de procedure is het ligeren van vooraf gevormd gevorkt DNA aan het RNAP-elongatiecomplex om een replicatievork stroomafwaarts van de frontale RNAP te vormen.

De derde stap van de procedure is het assembleren van de replizone en het initiëren van de synthese van de leidende streng bij de replicatievork. De laatste stap van de procedure is het isoleren van het DNA van de magnetische kralen en het zuiveren van het DNA via een PCR-opreinigingskolom. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die via een alkalische agarosegel van de gezuiverde radiogemarkeerde DNA-producten aantonen dat de roso stopt bij een frontale botsing met het transcriptiecomplex.

Hoi, ik ben Richard Pomerance van het laboratorium van Mike O'Donnell aan de Rockefeller University. Vandaag laat ik u de procedure zien voor het uitvoeren van een collisie van het ribosoom met een RNA-polymerase in de vaste fase. Ik gebruik deze procedure in ons laboratorium om te bestuderen hoe het replicatieproces wordt beïnvloed door transcriptiecomplexen langs het DNA.

Laten we beginnen. Meng voor dit protocol RNAP holo-enzym met een gebiotineerd 3,6 KB DNA-template dat de T7 A1-promotor bevat in 100 µL buffer a en incubeer het mengsel 10 minuten bij 37 °C. Voeg na de incubatie van 10 minuten ribonucleotiden adenosine-trifosfaat, cytidine-fosfaat en adenine-uridine toe, waarmee de RNA-synthese wordt beperkt tot 20 nucleotiden.

Incubeer de oplossing nog 10 minuten bij 37 °C om het gestopte RN ape-elongatiecomplex op de kralen te immobiliseren. Voeg de oplossing toe aan streptavidine-gecoate magnetische kralen. Laat het mengsel 10 minuten incuberen bij kamertemperatuur.

Zuiver het geïmmobiliseerde gestopte RNAP-elongatiecomplex door de kraaltjes te wassen met 0,9 milliliter hoog-zoutbuffer. Verwijder na elke wasbeurt het supernatant via magnetische scheiding om aspecifieke R-N-A-P-D-N-A-complexen te verwijderen. Deze wasbeurt dient vijf keer herhaald te worden.

Was de kralen vervolgens nog twee keer met 0,9 milliliters buffer A. Na de laatste wasbeurt kan de downstream replicatievork worden geassembleerd om een replicatievork downstream van de head-on RNAP te vormen. Resuspendeer de magnetische strip met de kralen die gebonden zijn aan het gestopte RNAP-elongatiecomplex in 100 microliters New England Biolabs buffer vier. Voeg vervolgens 10 units shrimp alkaline phosphatase of SAP toe en incubeer het monster 10 minuten bij 37 degrees Celsius. Was de kralen drie keer met 0,9 milliliters buffer A. Resuspendeer de kralen daarna in 50 microliters quick T four ligatiereactiebuffer.

Voeg twee µL quick T4-ligase toe aan het vooraf gevormde geforkte DNA en incubeer de oplossing 10 minuten bij kamertemperatuur. Was daarna de beads nog drie keer met 0,9 mL buffer A. Meng hexameer-DNA-helicase met de magnetische streptavidine-beads die zijn gebonden aan het gestopte RNAP-elongatiecomplex en de stroomafwaartse replicatievork. Bereid de oplossing voor in 150 µL buffer A en incubeer deze 30 seconden bij 23 °C.

Na de korte incubatie bij 23 °C, voeg aan polymerase drie beta clamp, A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P α P 32 gelabelde DGTP en α P 32 gelabelde DATP toe tot een volume van 200 µL. Incubeer het monster vijf minuten bij 37 °C.

Start de replicatie door enkelstrengs-DNA-bindend eiwit, DCTP en DTTP toe te voegen. Voeg daarnaast alpha P 32-gelabelde DTTP en DCTP toe tot een eindvolume van 250 µL. Beëindig de reacties na 10 minuten door 12 µL 0,5 M EDTA toe te voegen.

Kook vervolgens de strp din-beads om het DNA van de beads vrij te maken. Verwijder eventueel resterend DNA door de beads 30 minuten lang te behandelen met proteinase K bij 50 °C. Kook de beads opnieuw en verwijder het supernatant via magnetische scheiding.

Zuiver het gecombineerde supernatant dat het DNA bevat met de Kyogen PCR-zuiveringskit. Analyseer vervolgens de gezuiverde radiogemarkeerde DNA-producten in een alkalische agarosegel. Een botsing van de zone met een RNAP resulteert gewoonlijk in twee producten met een lengte van 2,5 KB en 3,6 KB. Het product van 2,5 KB representeert de lengte van het DNA vanaf de replicatievork tot aan de gestopte RNAP.

Dit is het resultaat van het stilvallen van de replicatievork bij collisie met de RNAP. Het product van 3,6 KB vertegenwoordigt DNA van volledige lengte en is het resultaat van ofwel een onvolledige bezetting van de promotor door RNAP of een gedeeltelijke replicatiedoorbraak van de frontale RNAP. Een goed resultaat laat zien dat ongeveer 50% DNA van volledige lengte wordt geproduceerd.

In sommige gevallen treedt er echter een lagere bezetting van de promotor door RNAP op en wordt een hoger percentage volledig lengte DNA waargenomen. Dit komt omdat een groter deel van de replicatiezones in afwezigheid van een gestopte RNAP geen frontale botsing met de RNAP-replicatie ondervindt, wat resulteert in uitsluitend volledig lengte DNA. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u replicatie en vastfase-analyse uitvoert in de aanwezigheid van een gestopt RNA-polymerase-elongatiecomplex dat aan het DNA is gebonden. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om het gestopte transcriptiecomplex met een hoge zoutconcentratie te wassen om overtollig RNA-polymerase te verwijderen, dat aspecifiek aan het DNA bindt en de replicatie remt.

Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.