Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie

Dit experiment heeft tot doel vast te stellen of twee eiwitten in cellen met elkaar interageren en om aspecten van de interactieplaatsen te definiëren. Eerst worden cellen getransfecteerd met expressieconstructen die coderen voor de twee eiwitten van belang, waarvan er één is gefuseerd aan het N-terminus van een gefragmenteerd fluorescent eiwit en de andere gefuseerd is aan de complementaire C-terminus van het gefragmenteerde fluorescente eiwit. Nadat de getransfecteerde cellen in kweek de tijd hebben gehad om een fluorescent signaal te ontwikkelen, worden de eiwitcomplexen gevisualiseerd via imaging en immunoblottings.

Vervolgens worden de verzamelde afbeeldingen geëxporteerd naar beeldbewerkingssoftware zoals Image J om de gemiddelde fluorescentie-intensiteit per cel te kwantificeren. In een gecontroleerd experiment kunnen BIFC-resultaten eiwit-eiwitinteracties en de lokalisatie van deze complexen aantonen, zoals de SH3-domeinen van het stegereiwit die interageren met het prolijnrijke domein van PI3K2β. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals colokalisatie, immunoprecipitatie en FRET is dat BFC de ruimtelijke lokalisatie van zwakkere, transiënte interacties in de cel mogelijk maakt. Bovendien vereist deze methode geen uitgebreide nabewerking van afbeeldingen, zoals wel het geval is bij FRET.

Deze methode kan belangrijke vragen op het gebied van signaaltransductie beantwoorden, zoals of eiwitten X en Y interageren en, indien dat zo is, in welke specifieke compartimenten van de cel deze complexen gelokaliseerd zijn? Over het algemeen zullen nieuwkomers bij deze methode moeite hebben omdat ze niet de juiste configuratie hebben gekozen voor de expressie van hun biopsie. Gemarkeerde eiwitten van belang Begin met het selecteren van een van de meerdere fluoroforen voor de BIFC-fusie-eiwitten.

Houd er rekening mee dat de amino- en carboxyterminale uiteinden van Venus in staat zijn om een complex te vormen bij 37 °C, terwijl de Y-F-P-B-I-F-C-fragmenten een pre-incubatie bij 30 °C vereisen. Ontwerp expressievectoren voor de toevoeging van tags aan de eiwitten van belang door te overwegen hoe de aanhechting van de BIFC-fragmenten de functie van de betreffende eiwitten kan beïnvloeden. Zo zijn GTPα's uit de RA-familie lipide-gemodificeerd aan de carboxyterminus en kunnen ze aan dit uiteinde niet worden getagd zonder deze modificatie te verstoren.

Voer altijd proefexperimenten uit om de transfectiecondities te bepalen. Monitor de cellen daarnaast via fluorescentiemicroscopie om het optimale tijdstip voor signaalontwikkeling vast te stellen. Voer vervolgens een western blot-analyse uit om de gelijke expressie van de constructen te bevestigen.

Het is belangrijk om een immunokleuring voor de HA- of flag-tag uit te voeren om te verifiëren dat de toevoeging van de BIFC-fragmenten de cellulaire lokalisatie van de eiwitten van belang voor elke monsterplaat niet verandert. Plaats 1,3 × 10⁵ van de vijf cellen op elke glazen bodemplaat en in twee wells van een zes-wellsplaat, en laat de cellen een nacht bezinken in een incubator van 37 °C. Bereid de volgende dag de DNA's voor transfectie via lipofectie of een andere voorkeurmethode.

Verdun eerst het DNA in 250 µL serumvrij DMEM als transfectiecontrole. Voeg CFP toe in een verhouding van 1:50 ten opzichte van de totale hoeveelheid BIFC-DNA's. Verdun vervolgens het liposoom in 250 µL serumvrij DMEM met 10 µL liposoom per 1 µg DNA.

Meng de DNA- en lipidverdunningen en incubeer deze gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Spoel de cellen twee keer met warm serumvrij DMEM. Voeg twee milliliters serumvrij DMEM toe aan elke glasbodemplaat of put van een zes-putsplaat.

Verdeel vervolgens elk transfectiemengsel gelijkmatig over één glazen bodemschaaltje en twee putjes van een plaat met zes putjes; incubeer de cellen gedurende vijf uur bij 37 °C. Verwijder tot slot het transfectiemedium en vervang dit door volledig DMEM-medium met 10% FBS.

Incubeer de cellen gedurende de tijd die in pilotexperimenten is bepaald om de benodigde expressieniveaus van de eiwitten van belang te verkrijgen. Onderzoek de getransfecteerde cellen onder een epifluorescentiemicroscoop om te bevestigen dat de positieve controle fluorescent is. Spoel de cellen drie keer met PBS voor live-cell imaging.

Plaats de cellen in medium zonder indicatorstoffen. Voor het imagen van gefixeerde cellen: voeg 2% paraformaldehyde toe en plaats dit 10 minuten op ijs.

Spoel de cellen vervolgens drie keer met PBS, voeg nu één milliliter PBS toe en bewaar deze in het donker bij vier graden Celsius, waarna de cellen in de zes-wellplaat onmiddellijk worden gelyseerd. Voor Western blot-analyses is het belangrijk dat alle cellen tegelijkertijd worden voorbereid, zodat de gelyseerde cellen representatief zijn voor de beeldecellen. Voer een Western blot uit om te bevestigen dat de tag-eiwitten in gelijke hoeveelheden tot expressie komen.

Bij het afbeelden van cellen met een confocale microscoop is het belangrijk om de instellingen gedurende het gehele experiment constant te houden, zodat de fluorescentie tussen monsters vergelijkbaar is. Zorg ervoor dat individuele cellen worden afgebeeld waarbij de pixels niet verzadigd zijn. Aangezien CFP is opgenomen als transfectiecontrole, mogen alleen CFP-positieve cellen worden geselecteerd voor de analyse van BIFC-signalen.

Kwantificeer de fluorescentie met behulp van imagingsoftware zoals Image J. Open de afbeeldingsbestanden in Image J. Ga naar 'analyze' en vervolgens naar 'set measurements'. Vink in het venster met metingen de vakjes voor 'area' en 'mean gray value' aan. Let op dat in dit voorbeeld de veneuze beelden pseudogekleurd zijn in het groen en de CFP-beelden pseudogekleurd in het rood.

Teken met het vrije selectie-instrument een omtrek rond de rand van de gehele cel in het CFP-kanaal en laat deze omtrek staan. Schakel over naar het YFP-kanaal. Ga naar analyse en meet de gemiddelde grijswaarde, die de gemiddelde fluorescentie-intensiteit per cel voor elke afbeelding weerspiegelt.

Teken een cirkel in het YFP-kanaal in een gebied waar geen cel aanwezig is. Voer een meting uit voor dit gebied als achtergrond. Trek de achtergrond af van elke afbeelding.

Bereken ten slotte de gemiddelde fluorescentie-intensiteit voor een populatie cellen door de gemiddelde gradewaarde minus de achtergrond te middelen voor alle cellen die in één monster zijn afgebeeld. Kwantificeer idealiter 60 cellen over drie experimenten. Het multi-domein scaffolding-eiwit intersecting reguleert het overleven van neuronen via regulatie van een nieuwe klasse twee PI 3-kinase, PI 3KC2β; de SH3-domeinen van intersecting interageren met de amino-terminale proline-rijke regio van PI 3KC2β. Transfectie van VN-tagged intersecting met VC-tagged PI 3KC2β resulteert in een fluorescent signaal in het YFP-kanaal, dat pseudogekleurd is in het groen, wat duidt op complexvorming.

CFP, hier in het rood pseudogekleurd, wordt gebruikt als controle om getransfecteerde cellen te markeren; mutaties in het prolinerijke domein van PI three KC two beta, die de coprecipitatie van intersecting en PI three KC two beta verstoren, verminderen het BIFC-signaal. Dit verschil in het BIFC-signaal is niet te wijten aan verschillen in de expressie van de wild-type en PA PI three K-eiwitten. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in drie dagen worden uitgevoerd mits correct uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure moet u er rekening mee houden dat u de juiste controles uitvoert en de eiwitexpressie controleert om er zeker van te zijn dat verschillen in het BC-signaal te wijten zijn aan verschillen in complexvorming en niet aan de expressie na deze procedure.

Andere technieken, zoals surface plasmon resonance, kunnen worden uitgevoerd om vragen te beantwoorden zoals: wat zijn de verschillende affiniteiten van deze complexen voor elkaar?