Detectie van eiwit interacties in Plant met behulp van een Gateway-compatibele Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) Systeem

Om de interactie tussen twee eiwitten te testen, moeten de twee genen van belang in onze BF- en vectoren worden gekloond met behulp van de gateway-cloningtechniek. Deze constructen worden getransformeerd in aerium GV 3 1 0 1. De GV 3 1 0 1 bacteriële culturen die de constructen bevatten, worden gemengd en samen geïnfiltreerd in de bladeren.

Indien de twee kandidaate eiwitten met elkaar interageren, kan het YFP-signaal worden waargenomen met behulp van outcome focal Mexico. Het hoofddoel van de BFC-techniek is het testen van de interactie tussen twee eiwitten. Bij vavo hebben we een reeks gateway-compatibele BFC- en IS-two-hybrid-vectoren ontwikkeld, die onderzoekers voorzien van gebruiksvriendelijke instrumenten voor het uitvoeren van zowel BFC- als ISTO-two-hybrid-assays.

In deze video gaan we de eenvoud van het gebruik van ons BFC-systeem demonstreren. Om eiwit-eiwitinteracties in een unbe-manier transcend-expressiesysteem te testen, moet u eerst de GV 3 1 0 1 bacteriële cultuur voorbereiden.

Selecteer een enkele kolonie van uw plaat en inoculeer deze in 5 ml YEB-medium met de juiste antibiotica. Schud deze culturen vervolgens gedurende de nacht bij 28 °C. De snelheid is 200 rpm.

De bacteriële culturen zouden de volgende ochtend klaar moeten zijn. Controleer of de bacteriën niet zijn overgegroeid. Haal de culturen uit de incubator en breng een monster van elke cultuur over naar een steriele 1,5 mL centrifugebuis.

Plaats de centrifugebuizen in een tafelcentrifuge. Centrifugeer de bacteriën 10 minuten lang bij 1000 G bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant. Was vervolgens het pellet door één volume infiltratiemedium toe te voegen en door het pellet een paar keer voorzichtig te resuspenderen.

Herhaal de wasstap nog twee keer. Dit is belangrijk omdat het helpt om sporen van antibiotica in het bacteriële medium te verwijderen, die anders de plantencellen na infiltratie kunnen beschadigen. Na de laatste wasbeurt wordt het pellet opnieuw gesuspendeerd in 0,5 mL infiltratiemedium. Meet de OD600 van deze bacteriesuspensies met een spectrofotometer, waarbij infiltratiemedium als blanco controle wordt gebruikt.

Na de OD-meting moet de OD worden aangepast met infiltratiemedium. De uiteindelijke OD moet tussen 1 en 1,2 liggen. Alle bacteriële suspensies moeten worden voorbereid voordat u doorgaat naar de volgende stap.

Breng gelijke hoeveelheden bacteriële suspensies over die overeenkomen met uw twee kandidaateiwitten en meng deze in een nieuwe 1,5 ml buis. Dit negatieve bacteriële mengsel is nu klaar voor infiltratie. Bereid alle combinaties voor en vergeet niet een negatieve controle op te nemen. Gebruik voor de infiltratie planten van vijf tot zes weken oud in de beste conditie.

U kunt de planten uit de groeikamer halen en ze een uur voor de infiltratie in het donker plaatsen om de huidmondjes te openen. Dit zal het infiltratieproces vergemakkelijken. Trek ongeveer 100 µL van de resuspenderde bacteriën op.

Meng met een mannelijke slipped tip spuit zonder naald. Plaats de punt van de spuit tegen de onderzijde van het blad. Ondersteun de bovenzijde van de knie met uw vinger.

Druk over het algemeen op de zuiger. U zou de vloeistof door het blad moeten zien diffunderen naarmate deze de Meso-intercellulaire luchtruimtes vult. Markeer na infiltratie het geïnfiltreerde gebied met een viltstift. Anders zult u na twee dagen het geïnfiltreerde gebied niet meer kunnen identificeren. Als u verschillende bacteriële mengsels moet infiltreren, zorg er dan voor dat u uw handschoenen bespuit met 50% ethanol of dat u van handschoenen wisselt tussen de infiltraties door.

Probeer een tussenruimte van één meter tussen de infiltraties te laten om kruisbesmetting te voorkomen. De PFA-signalen moeten elke 24 uur worden gemonitord vanaf de infiltratie tot maximaal vijf dagen. U kunt twee afdekhoezen van verschillende maten gebruiken om het monster vast te houden.

Plaats eerst één druppel gedestilleerd water op een dekglas. Snijd vervolgens een klein stukje weefsel uit de geïnfiltreerde zone. Probeer een bloedvat in het monster te vermijden.

Plaats het met het mes gesneden weefsel in het water op het objectglas. Dek het af met een kleiner dekglas en druk voorzichtig aan. Het monster kan nu worden geobserveerd onder de microscoop. Hier gebruiken we deze NACA T CSS P twee confocale microscoop om het BiFC-signaal te visualiseren.

Een reguliere confocale microscoop kan worden gebruikt. Confocale microscopie levert betere beelden en detecteert zwakkere signalen. U kunt de YFP-parameter gebruiken om de VFC-signalen in dit NCAs P two-systeem te detecteren.

U kunt simpelweg dubbelklikken op deze YFP-preset hier, waardoor de excitatie automatisch wordt ingeschakeld en het emissiedetectiebereik wordt ingesteld. Als u een ander systeem gebruikt, raadpleeg dan de handleiding om de parameters correct in te stellen. We hopen dat u na het bekijken van deze video in staat bent om de BFCE uit te voeren om eiwit-eiwitinteracties te testen met behulp van het unbe MI Transcend expressiesysteem.

Deze procedure kan ook worden toegepast op tabaksplanten en AY-planten. Onze BFC-vectoren bevatten respectievelijk een HA- en flag-tag, waardoor u indien nodig ook co-IP kunt uitvoeren om de interacties te valideren.