High-throughput gist Plasmide Overexpressie Screen

Het algemene doel van deze procedure is om gistcellen te transformeren met een array-bibliotheek van plasma-DNA's. Dit wordt bereikt door eerst een geschikte hoeveelheid gistcellen te kweken. De gistcellen worden vervolgens behandeld met lithiumacetaat om ze competent te maken voor DNA-transformatie.

Transformeer vervolgens de competente e-cellen door ze te mengen met DNA. De laatste stap van de procedure is het selecteren en analyseren van de transformanten. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de effecten van het plasmida-DNA op gistfenotypen aantonen via gist-spottingassays en/of microscopie.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande protocollen, zoals standaard gisttransformaties, is dat het de transformatie van een groot aantal verschillende plasmiden in gistcellen op een geautomatiseerde manier mogelijk maakt. Dit high-throughput gisttransformatieprotocol is ontworpen voor 10 platen van 96 wells, maar kan naar behoefte worden op- of afgeschaald. Voor experimenten op grotere schaal is het organiseren van alle platen en reagentia de sleutel tot succes.

Zodra het experiment is gestart, wordt er in dit protocol een Biobot rapid plate liquid handler gebruikt om verwarring te voorkomen. Begin met het aliquoteren van 5 tot 10 µL plasma-DNA uit een array-gistplasmidbibliotheek in elke put van de ronde 96-wells platen met ronde bodem. Plaats de onafgedekte 96-wells platen overnacht in een schone laminaire flowkast om te drogen.

Inoculeer vervolgens 200 milliliter yeast peptide dextrose of YPD-medium met een query-stam in een 500 milliliter gebaffelde Lin Meyer-kolf en incubeer dit gedurende de nacht bij 30 °C onder schudcondities. Verdun de volgende ochtend de query-stam tot een OD 600 van 0,1 in twee liter YPD-medium voor optimale groei. Kweek culturen tot een volume van één liter in afzonderlijke gebaffelde kolven van 2,8 liter.

Schud de kolven vier tot zes uur bij 30 °C totdat de culturen een OD 600 van 0,8 tot 1,0 bereiken. Wanneer de gistcultuur een OD 600 van 0,8 tot 1,0 heeft bereikt, worden de cellen geoogst door centrifugatie. Vul vier wegwerp conische buizen van 225 ml met cultuur en centrifugeer deze 5 minuten bij 3000 RPM in een tafelcentrifuge.

Giet het S-supernatans uit elke buis af. Voeg meer cultuur toe aan dezelfde buizen en centrifugeer opnieuw; herhaal dit indien nodig totdat alle cellen zijn geoogst. Was elke celpellet in 50 milliliters autoclaaf-gedestilleerd water en resuspendeer door middel van vortexen.

Combineer de cellen in één conische buis van 225 ml en centrifugeer 5 minuten bij 3000 RPM. Verwijder na het afnemen van het supernatant de cellen en was deze in 100 ml lithiumacetaatoplossing. Centrifugeer opnieuw 5 minuten bij 3000 RPM.

Verwijder de SNA en resuspendeer de celpellet in 70 milliliters lithiumacetaatoplossing. Vortex op hoge snelheid gedurende ongeveer 30 seconden totdat de pellet volledig is geresuspendeerd. Incubeer onder schudding bij 30 degrees Celsius gedurende 30 minuten.

Voeg vervolgens beta-mercapto-ethanol toe tot 0,1 M en incubeer onder schudden bij 30 °C gedurende nog eens 30 minuten. Voeg na de incubatie van 30 minuten twee milliliter gekookt en afgekoeld zalmsperma-DNA toe aan het cellenmengsel. Giet het cellenmengsel in een autocleefbare plaat met één putje en verwijder vervolgens eventueel gevormd precipitaat, omdat dit het daaropvolgende pipetteren kan beïnvloeden.

Gebruik de biobot rapid plate om 50 µL van het cellenmengsel in elke put van de vier eerder geprepareerde 96-wells platen met plasma-DNA te pipetteren; meng dit niet. Incubeer de platen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur zonder schudden terwijl de cellen incubeeren.

Bereid 200 milliliter PEG DMSO lithiumacetaat-oplossing. Meng 160 milliliter 50%PEG 33, 50, 20 milliliter DMSO en 20 milliliter één molair lithiumacetaat. Het is belangrijk dat deze oplossing vlak voor gebruik wordt bereid.

Voeg 125 µL PEG lithiumacetaat DMSO-oplossing toe aan elk monster. Meng grondig door de celсусpensie acht keer op te zuigen en weer te dispenseren. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur zonder te schudden.

Zet de cellen vervolgens 15 minuten lang bloot aan een hittestress van 42 °C in een droge incubator; stapel de platen na de hittestress niet op. Centrifugeer de platen met behulp van centrifuge-adapters die geschikt zijn voor 96-wells platen. Verwijder na centrifugatie de PEG-oplossing door de platen boven een afvalbak om te keren. Dep de omgekeerde platen vervolgens droog met keukenpapier.

Om resterende vloeistof te verwijderen, blijven de cellen op de bodem van de wells. Spoel de cellen door 200 µL minimaal medium aan elke well toe te voegen. Centrifugeer de platen opnieuw.

Verwijder het supernatant door de plaat boven een afvalbak om te keren en te drogen op papieren handdoeken. Voeg met een rapid plate incubatie 200 µL minimaal medium toe aan elke put en incubeer gedurende twee dagen bij 30 °C zonder schudden. Na twee dagen zouden er kleine celkolonies moeten ontstaan op de bodem van elke succesvol getransformeerde put.

Om u voor te bereiden op de Spatting-assay, doseer eerst 200 µL OSE-gebaseerd minimaal medium in elke put van een nieuwe vlakbodem 96-well plaat. Meng vervolgens elke put van de transformatieplaat door de cel-suspensie acht keer op te zuigen en weer te dispenseren met een rapid plate.

Inoculeer elke well van de raffinoseplaat met vijf µL van het celmengsel van de transformatieplaat en incubeer dit gedurende één dag bij 30 °C. De volgende dag zouden er kleine kolonies aanwezig moeten zijn op de bodem van elke well.

Voer de spotting-assay uit in de zuurkast en steriliseer een 96-pins replicator of frogger door middel van vlammen. Meng de kolonies met een frogger en spot vervolgens de kolonies op selectieve mediumplaten. Laat de platen na het spotten vijf tot 10 minuten drogen in de zuurkast.

Incubeer de platen bij 30 °C gedurende twee tot drie dagen. Hier worden representatieve resultaten getoond van een gist-plasmide overexpressiescreening om suppressoren en enhancers van TDP 43-toxiciteit te identificeren. TDP 43 is een menselijk eiwit dat betrokken is bij de pathogenese van amyotrofische laterale sclerose of de ziekte van Lou Gehrig; de expressie van TDP 43 in gistcellen leidt tot aggregatie en cytotoxiciteit.

Deze platen tonen kolonies met een geïntegreerd galactose-induceerbaar T DP 43-plasmide die daarnaast zijn getransformeerd met plasmiden uit de flex-gen ORF-expressiebibliotheek. De kolonies hier hebben een rode kleur omdat de stam een mutatie heeft die leidt tot de accumulatie van een rood pigment. De plaat links bevat glucose, wat de expressie van T DP 43 of de flex-gen-plasmiden onderdrukt.

De plaat rechts bevat galactose, wat de expressie van TDP 43 en de O Fs in de flex-genplasmiden induceert. De groene pijl wijst naar een kolonie die is getransformeerd met een plasmide dat de toxiciteit van TDP 43 onderdrukt, wat blijkt uit een snellere groei en dichtere kolonies. De rode pijl wijst naar een kolonie die is getransformeerd met een plasmide dat de toxiciteit van TDP 43 verhoogt, wat blijkt uit een tragere groei en minder dichte kolonies.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een bibliotheek van plasma-DNA's uit cellen kunt transformeren.