ReAsH / Flash Labeling en beeldanalyse van Tetracysteine ​​Sensor eiwitten in cellen

Het algemene doel van deze procedure is om cellen die een tetra-cysteïne en fluorescentie-gelabeld eiwit tot expressie brengen te labelen met de kleurstoffen flash of ash, en om de resultaten kwantitatief te analyseren. Dit wordt bereikt door eerst een plasmide dat een fluorescent eiwit en het doeleiwit met een tetra-cysteïne-tag bevat, te transfecteren in de betreffende cellijn. Vervolgens wordt het tot expressie gebrachte eiwit gelabeld met R of flash, en wordt de aspecifiek gebonden kleurstof verwijderd door te wassen met BAL ter voorbereiding op microscopische beeldvorming.

Vervolgens wordt een confocale microscoop gebruikt om fluorescentiebeelden van de cellen op te nemen met de ash- of flash- en fluorescentie-eiwitkanalen. Ten slotte worden de beelden geanalyseerd met ImageJ om de binding van ash of flash aan het doeleiwit te kwantificeren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de mate van ash- of flash-binding aan het doeleiwit in cellen aantonen via de correlatie van ash-fluorescentie met fluorescentie-eiwitfluorescentie.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het simpelweg labelen van het doeleiwit met GFP, is dat een tweede eigenschap van het eiwit kan worden gevolgd, zoals conformationele veranderingen in aanvulling op de lokalisatie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van eiwit-substructuur en functie, zoals oligomerisatie-gebeurtenissen, conformationele veranderingen en LI-bindingsgebeurtenissen die het vermogen van de TAC om te flashen of te knipperen beïnvloeden. We kregen oorspronkelijk het idee voor deze methode toen we wilden beoordelen hoe kleine submicroscopische aggregaten van mutant Huntington in cellen werden gevormd.

Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de stappen voor data-analyse moeilijk aan te leren zijn vanwege de technische complexiteit. Ter demonstratie van de experimentele procedures zullen stappen één tot en met drie worden uitgevoerd door Yasmin Ranson, een onderzoeksassistent uit ons laboratorium, die de data-analyse zal demonstreren. Stap vier zal worden uitgevoerd door Sevki GaN, een promovendus uit ons laboratorium. Gebruik standaard celkweekmethoden voor de gewenste cellijn en een live-cell imaging slide die klaar is voor transfectie.

Bereid een cultuur van adherentcelen voor en transfect deze met uw plasmide dat het TC-taggen van het gen van belang bevat. Volg hierbij de transfectiemethode naar keuze. Het is belangrijk om positieve en negatieve controles te hebben om de mate van specifieke binding aan de TC-tags te beoordelen, evenals om eventuele bleed-through van fluorescentie tussen kanalen vast te stellen bij het verzamelen van confocale micrografieën. Zorg daarom, bij gebruik van twee kleuren, dat monsters worden voorbereid voor enkelvoudige kleuren: enerzijds het fluorescerende eiwit alleen en, indien mogelijk, een T-proteïne gebonden aan flesh of vice versa.

Maar zonder een fluorescent eiwit. Spoel de cellen één tot twee dagen na transfectie voorzichtig af met 300 µL voorverwarmde Hank's balanced salt solution of HBSS. Bereid verse, voorverwarmde HBSS voor met 10 µM 1,2-ethanedithiol of EDT en 1 µM flash of ash. Vervang de HBSS na verwijdering voorzichtig door 300 µL van het ash-medium en laat dit precies 30 minuten incuberen bij 37 °C in een weefselkweekincubator.

Uit onze ervaring blijkt dat langere incubatietijden de achtergrondfluorescentie aanzienlijk verhogen. Aspireer de labelingsoplossing voorzichtig van de cellen en vervang deze door 300 µL voorverwarmde HBSS met 250 µM 2,3-dimeer, cap-propanol of BAL gedurende 15 minuten bij 37 °C. Verwijder de wasoplossing door voorzichtig te aspireren en vervang deze door 300 µL voorverwarmde HBSS.

Na deze wasstap kunnen de cellen worden gefixeerd met paraformaldehyde, hoewel we hebben vastgesteld dat dit de aspecifieke cytoplasmatische fluorescentie verhoogt. Daarom beelden we de cellen gewoonlijk levend af bij kamertemperatuur. Bovendien voorkomt fixatie van de cellen vóór labeling de binding van de kleurstof.

Om te beginnen met het imagen van cellen op de confocale microscoop, stelt u de parameters in voor het imagen van de individuele fluoroforen en zorgt u ervoor dat er een verwaarloosbare bleed-through tussen de kanalen is. Pas vervolgens de instellingen van de fotomultiplicator aan, zodat de maximale fluorescentie in het monster de detector niet verzadigt. Zodra de optimale imaging-instellingen zijn bepaald, mogen deze tussen de verschillende monsters niet meer worden gewijzigd.

Gebruik een scansnelheid van 200 hertz, verzamel vier lijngemiddelden en stel de pinhole-diameter in op één area unit. De pinhole-diameter kan worden vergroot als de signaal-ruisverhouding een probleem vormt. Dit kan echter leiden tot enig verlies van beeldresolutie.

Veramel de confocale beelden indien mogelijk in een 12-bit formaat of hoger om de kwaliteit van de kwantitatieve data-analyse te maximaliseren. Verzamel beelden voor het fluorescerende proteïnekanaal en ook voor het BI arsenal-kleurkanaal voor alle monsters.

Gebruik voor de analyse van de gegevens Image J-software met de volgende plug-ins. Indien u een versie van Image J gebruikt die ouder is dan versie 1.32 C, selecteer dan de volgende opties. Om het gelijktijdig openen van meerdere afbeeldingen mogelijk te maken, gaat u naar edit options input slash output en vinkt u het vakje use j file chooser to open slash share aan.

Klik op oké. Open de gewenste afbeeldingen. Image J zal automatisch de maximale en minimale pixelintensiteiten definiëren die op het scherm worden weergegeven voor elke afbeelding afzonderlijk, aangezien verschillende afbeeldingen verschillende pixelintensiteiten hebben.

Dit betekent dat de weergegeven afbeeldingen in hun huidige weergave niet vergelijkbaar zijn. Om ervoor te zorgen dat de geopende afbeeldingen allemaal op dezelfde schaal staan, moeten de bovenste en onderste pixelintensiteiten die worden weergegeven fysiek worden gedefinieerd. Om deze waarden in te stellen, kiest u 'image' en past u 'brightness/contrast' aan.

Klik op 'set' en definieer de minimale en maximale weergavewaarden. Kies vervolgens voor 'propagate to all open images' en klik op oké. Als alternatief kunnen alle afbeeldingen voor een specifiek kanaal samen in één enkel bestand of stack worden geplaatst.

Image J zal vervolgens automatisch alle afbeeldingen naar dezelfde schaal aanpassen. Kies hiervoor 'image stacks', vervolgens 'images to stack', voer een naam in die voor elk bestand gemeen is en selecteer 'used titles as labels'. Klik op ok.

Zet alle geopende afbeeldingen om naar acht bits voor de analyse. Door het afbeeldingstype acht bits te kiezen, wordt het bekeken bereik geschaald naar een interval van 0 tot 255. Het is belangrijk om niet over het originele 12-bits of hogere formaat heen op te slaan, omdat dit tot informatieverlies zou leiden.

Sla een kopie op in een nieuwe map met de naam "eight bit converted" via de optie 'Opslaan als'. Een methode om de omvang van de binding van bi arsal-kleurstof in een volledig beeld te onderzoeken, is het maken van een pixelintensiteit-correlatieplot. Deze plot zet elke pixelwaarde in één kanaal uit tegen de overeenkomstige pixelwaarde in een tweede kanaal.

Bij een sterke binding zal een pixelpositie met een hoge GFP-fluorescentie dus ook een hoge asfluorescentie vertonen. Om de pixelcorrelatie te analyseren, moet u ervoor zorgen dat de 8-bits REA- en GFP-afbeeldingen geopend zijn in ImageJ. Open vervolgens de Image Correlator-plugin door te kiezen voor Plugins > Image Correlator. Wijs de afbeeldingsbestanden toe aan afbeelding één en afbeelding twee.

Klik vervolgens op oké. De resulterende stack geeft mogelijk geen gedetailleerde informatie weer. Dit is normaal.

Sla de stack op in een nieuwe map genaamd scatterplots en geef deze dezelfde bestandsnaam als het monster waarnaar deze verwijst. Bijvoorbeeld, Ash GFP Correlation plot. Om de gegevens te bekijken, kunt u kiezen uit een van de twee opties.

Transformeer eerst de gegevens naar een log-formaat door te kiezen voor process math log auto. Klik vervolgens op image adjust brightness slash contrast en selecteer auto om de gegevens visueel opnieuw te schalen. Schaal de gegevens daarna visueel opnieuw om alleen lage waarden te tonen en visualiseer de gegevens met een speciale opzoektabel of LUT om een aangepaste LUT te maken.

Klik op 'image color edit LUT' voor een zeer eenvoudige LUT. Klik op de pixel linksboven en kies de kleur zwart. Selecteer vervolgens de volgende pixel naar rechts en kies de kleur rood.

Klik vervolgens op de derde pixel en sleep, terwijl u de muisknop ingedrukt houdt, de selectie naar de pixel rechtsonder. Selecteer de kleur rood, klik op oké, selecteer vervolgens de kleur wit en klik op oké. Selecteer het bereik voor helderheid/contrast van 0 tot 255 zoals eerder beschreven om het beeld vast te leggen zoals getoond op het scherm.

Converteer het naar RGB-formaat om afbeeldingen naar andere programma's te kunnen kopiëren en plakken. Open eerst de 8-bit of 16-bit afbeeldingen zoals eerder beschreven. Ken een LUT-kleurenschema toe aan de afbeeldingen voor GFP.

Wijs de groene LUT toe door op de afbeelding te klikken. Look up tables groen. Selecteer ten slotte de afbeelding die u wilt kopiëren en kopieer deze naar het klembord. Door te kiezen voor 'edit copy to system' wordt deze figuur getoond; deze laat een typisch resultaat zien voor de kinase sock fused, het GFP en een TC-tag die gedurende 30 minuten is gekleurd.

Bij ash in HEC 2 9 3-cellen blijkt dat ASH met een hoge affiniteit efficiënt bindt aan het doeleiwit dat een TC-tag draagt. In tegenstelling hiermee toont deze figuur de overeenkomstige controlemonster van SARK gefuseerd aan GFP, maar zonder de TC-tag, wat essentieel is voor het verifiëren van zowel de specificiteit van de TC-tag als het niveau van achtergrondkleuring. Dit resultaat laat zien dat RH geen reactiviteit vertoont met het doeleiwit dat de TC-tag mist, wat de specificiteit van de TC-tag voor SSH-binding aantoont.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de cellen niet confluent en rustig mogen worden, aangezien dit de V-binding in cellen zal beïnvloeden. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u uw gegevens eenvoudig kwantitatief kunt analyseren, en u kunt deze methoden verfijnen om uw eigen unieke IUTS voor datavisualisatie te ontwikkelen.