Waarom is het testen van de nulhypothese belangrijk voor dubbele labelings-immunofluorescentie?

Toetsing van de nulhypothese waarborgt dat de waargenomen colocalisatie of segregatie van eiwitten van de gastheer en het pathogeen statistisch significant is, waardoor het risico op fout-positieve mechanistische interpretaties in workflows voor targetvalidatie wordt verminderd.

Hoe past de isolatie van de onafhankelijke variabele in de workflow voor antilichaamlabeling?

Door variabelen zoals antilichaamspecificiteit en de keuze van de fluorofoor te isoleren, kunnen teams waargenomen signalen toeschrijven aan de beoogde eiwitdoelen, wat robuuste analyses in de ontdekkingsfase ondersteunt en storende effecten minimaliseert.

Wat maken kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen mogelijk bij confocale beeldvorming?

Kwantitatieve metingen van fluorescentie-intensiteit en ruimtelijke distributie maken een objectieve vergelijking van eiwitlokalisatie over verschillende experimentele condities mogelijk, wat bijdraagt aan mechanistische hypothesen en de prioritering van targets.

Waarom zijn replicatie-eisen cruciaal voor cross-functionele immunofluorescentiestudies?

Replicatie zorgt ervoor dat waargenomen eiwitlokalisatiepatronen reproduceerbaar en betrouwbaar zijn, wat de integratie van gegevens tussen teams vergemakkelijkt en gezamenlijke besluitvorming in R&D-pipelines ondersteunt.

Welke statistische analysecapaciteiten zijn vereist vóór de implementatie van assays op basis van beeldvorming?

Robuuste statistische tools zijn nodig om fluorescentiegegevens te analyseren, de significantie te beoordelen en variabiliteit te beheersen, zodat imaging-resultaten met vertrouwen kunnen bijdragen aan besluitvorming over de voortgang op portefeuilleniveau.

A Double-Labeling Immunofluorescence Technique to Visualize Host and Pathogen Proteins in an Infected Cell

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

0 weergaven • 3:44 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Begin with fixed and permeabilized epithelial cells infected with a pathogenic parasite.

Add a blocking buffer to prevent non-specific antibody binding.

Overlay with mouse polyclonal primary antibodies, specifically interacting with the parasite's proteins.

Add far-red fluorophore-labeled secondary antibodies that interact with parasitic protein-bound primary antibodies.

Wash to remove unbound antibodies. Block with anti-mouse antibodies that bind to primary antibodies, minimizing the cross-reactivity during host-protein labeling.

Add mouse monoclonal primary antibodies targeting host ribonucleoproteins within epithelial cells.

Overlay with a mix of green fluorophore-labeled secondary antibodies and red fluorophore-conjugated phalloidin, facilitating the labeling of host protein-bound primary antibodies and actin, respectively.

Wash with a buffer. Mount using a DNA stain-containing medium, imparting a blue coloration to the host nucleus, parasite nucleus, and kinetoplast.

Analyze the samples using a confocal microscope. The double-labeling immunofluorescence technique shows green host proteins and red parasitic proteins, enabling their precise subcellular localization.

Add LLC-MK2 cells in 24-well plates containing UV-sterilized rounded coverslips and allow them to settle for 16 hours. Then to infect the cells, add supernatant containing T. cruzi to each well, and incubate for six hours. Next, wash the coverslips containing the infected and non-infected cells 5 times with PBS.

Then, fix the cells with 2% paraformaldehyde and PBS. After 10 minutes, wash the coverslips three times for 5 minutes each with PBS, and then permeabilize the coverslips with non-ionic detergent for 10 minutes.

After three 5-minute PBS washes, incubate the coverslips in blocking solution for 30 minutes, followed by another 30-minute incubation with either a mouse monoclonal or polyclonal antibody. After washes, incubate the coverslips for 30 minutes with secondary antibody in blocking solution and phalloidin to stain actin filaments in the host cell.

Then, wash the coverslips with PBS three times again before applying a small amount of anti-fade mounting reagent with DAPI medium to the surface of the slide. Using forceps, gently tilt the coverslip in the medium to prevent bubble formation.

For double labeling, after incubating the coverslips and blocking solution as demonstrated previously, incubate them in the mouse polyclonal antibody for 30 minutes. Next, wash the coverslips three times for 5 minutes each with PBS before incubating them with the secondary antibody for 30 minutes.

Gerelateerde video's

0 Bekeken

Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026

A Double-Labeling Immunofluorescence Technique to Visualize Host and Pathogen Proteins in an Infected Cell

Overzicht

Belangrijkste componenten van de studie

Wetenschappelijk gebied

Achtergrond

Doel van de studie

Gebruikte methoden

Belangrijkste resultaten

Conclusies

Veelgestelde vragen

Industriële Relevantie voor Directie

Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D

Vroege Ontdekking & Targetvalidatie

Screening & Assay-ontwikkeling

Translationeel & Preklinisch Onderzoek

Integratie van Pipeline & Workflow

Operationele & Bedrijfsimpact

Overwegingen voor implementatie

Biopharma Veelgestelde Vragen

Orgelcultuur en Whole Mount immunofluorescentiekleuring van Muis gangen van Wolff

Identificatie van de skeletspieren satelliet cellen met immunofluorescentie met Pax7 en Laminin antilichamen

Multiplex immunofluorescentie gecombineerd met ruimtelijke beeldanalyse voor de klinische en biologische beoordeling van de micro-omgeving van de tumor

Een techniek om tegelijkertijd Visualiseer virus-specifieke CD8 + T-cellen en virus-geïnfecteerde cellen In situ

Detectie van virale RNA door fluorescentie

An Immunofluorescence Technique for Viral Protein Localization in Infected Cells

Differentiële Labeling van Cell-oppervlak en Internalized Eiwitten na Antibody Voeden van Levende gekweekte neuronen

Immunofluorescentie te zien op de cellulaire opname van humaan lactoferrine en de Associated antivirale activiteit tegen het hepatitis C virus

Temporele analyse van de nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie van een Herpes Simplex Virus 1 eiwit door immunefluorescentie confocale microscopie

Eencellige multiplexed fluorescentie beeldvorming om virale nucleïnezuren en eiwitten te visualiseren en HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika-virus en influenza-infectie te controleren