Selecteren en isoleren van Koloniën van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen geherprogrammeerd tegen Adult Fibroblasten

In dit videoartikel worden menselijke adulte fibroblasten gereprogrammeerd om pluripotente stamcellen te genereren met behulp van retrovirale vectoren. Eerst worden menselijke fibroblasten getransduceerd met retrovirale vectoren die coderen voor de transcriptiefactoren T three four, SOX two, KLF four en cmic.

De geïnfecteerde fibroblasten worden gedurende 14 tot 28 dagen gekweekt op embryonale feeder-cellen van muizen. De resulterende culturen worden gekleurd met TRA 180 1-antilichamen om kolonies van hergeprogrammeerde cellen te identificeren. Positieve kolonies worden vervolgens overgezet naar platen die MEF bevatten voor expansie.

Immunocytochemische kleuring bevestigt de expressie van pluripotentiemarkers en de totstandkoming van pluripotente stamcellijnen. Vervolgens moeten aanvullende studies worden uitgevoerd om de lijnen verder te karakteriseren. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met het herprogrammeren van somatische cellen en menselijke geïnduceerde pluripotente stamcelculturen moeite hebben, omdat het lastig is om de juiste IPSC-koloniën te identificeren.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Sula Pollak, post-doc fellow uit mijn laboratorium. Begin deze procedure door Phoenix AM FO-cellen uit te platen bij een dichtheid van ongeveer 7 tot 8 miljoen cellen per 10 centimeter plaat in 10 milliliters high glucose DMEM; plaats deze in de incubator en kweek ze overnacht. Bereid de volgende dag transfectiemengsels voor bestaande uit 12 micrograms van een vector die coderend is voor respectievelijk T34SOX, 2KLF, 4CMIC of het GFP-gen en 35 microliters FuGENE6 in een totaal volume van 500 microliters serumvrij high glucose DMEM met L-glutamine.

Incubeer de mengsels gedurende 20 minuten. Pipetteer vervolgens de DNA-complexen voorzichtig in de platen met phoenix-cellen, die 70 tot 80% confluent moeten zijn, om de phoenix-cellen te transfecteren. Incubeer de cellen na zes tot acht uur bij 37 °C.

Zuig het medium af en vervang dit door acht milliliters high glucose DMEM met antibiotica. Plaats de platen vervolgens gedurende 12 uur terug in de incubator na de incubatie. Gebruik een pipet om het virusbevattende medium af te zuigen en te verzamelen.

Vervang vervolgens het medium en herhaal dit proces elke 12 uur totdat het medium vier keer is verzameld. Bewaar het medium bij vier graden centigrade. Zodra al het medium is verzameld, worden alle porties gecombineerd en vervolgens door een tube top-filter van 0,45 micrometer in een conische buis van 50 milliliter gegoten om losgekoppelde cellen en debris te verwijderen.

Het gefiltreerde medium, dat virale partikels bevat, kan twee weken in de koelkast worden bewaard zonder verlies van infectieuze activiteit. Bevriezen wordt niet aanbevolen. Ontdooi de dag vóór de transductieprocedure de bevroren voorraad volwassen menselijke fibroblasten en voeg 1 × 10⁵ cellen per well toe aan zes-wells platen die met gelatine zijn gecoat.

Combine de volgende dag in een conische buis van 50 milliliter telkens 3,5 milliliter T four SOX two, klf four en cmic virale medium, en voeg poly brain toe tot een eindconcentratie van zes microgram per liter als controle. Bereid één milliliter GFP viraal medium, drie milliliter kweekmedium en poly brain voor bij een eindconcentratie van zes microgram per milliliter. Aspireer het medium van de plaat met menselijke fibroblasten.

Voeg vervolgens vier milliliters gemengd viraal medium of controlemedium toe en centrifugeer de platen bij 1600 G gedurende één uur bij 20 °C. Incubeer de platen na de centrifugatie ongeveer 12 uur. Vervang daarna het virale medium door fibroblast-kweekmedium en incubeer nogmaals 12 uur.

Herhaal dit proces van infectie tot kweek in fibroblastmedium nog twee keer na de laatste infectie. Kweek de fibroblasten 48 uur lang in DMEM. Controleer vervolgens de efficiëntie van de infectie van de parallelle transducties met het GFP-retroviraal medium.

Vervolgens wordt de herprogrammering van somatische naar pluripotente cellen gestart. De geïnfecteerde fibroblasten worden gekweekt in menselijk embryonaal stamcelmedium of HES-medium; zaai muis embryonale fibroblasten of MEF's uit bij een dichtheid van ongeveer 2 × 10⁵ cellen per putje van een met gelatine behandelde zes-putsjesplaat in fibroblastgroeimedium. De volgende dag

Splits de geïnfecteerde humane fibroblasten met 0,05% tripsin-EDTA en zaai ze uit met een dichtheid van ongeveer 1,2 × 10⁴ per putje in het fibroblastgroeimedium. Vervang de volgende dag het medium door HES-medium bevattende 0,5 mM natriumbutyraat voor de eerste zeven dagen van de herprogrammering.

Vervang het medium dagelijks. Vervang de media door HES-medium zonder natriumbutyraat en ga door met het herprogrammeren gedurende nog eens zeven tot 21 dagen. Vervang het medium elke dag.

Controleer de getransduceerde cellen op morfologische veranderingen. Kolonies cellen zullen ongeveer 10 dagen na het overbrengen van de getransduceerde fibroblasten op feeder-cellen verschijnen. De kolonies die de gereprogrammeerde cellen bevatten, worden nu aangeduid als menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen of menselijke IPS-cellen.

De menselijke IPS-celkolonies zullen 14 tot 28 dagen na het uitplaten op de MEF-voedercellen klaar zijn om te worden geïsoleerd. In dit stadium kunnen menselijke IPS-celkolonies worden overgebracht naar platen die ofwel MEF bevatten of met matrigel zijn bedekt. De overdracht naar de platen met MEF wordt gedemonstreerd een dag voordat de menselijke IPS-celkolonies worden geoogst. Zaai 24-wells platen met gamma-bestraalde MEF-voedercellen in fibroblastgroeimedium.

Incubeer op 37 °C met 5% CO2 op de dag dat de menselijke iPS-celkolonies worden opgepikt. Aspireer het fibroblastgroeimedium van de ME Fs en spoel ze met PBS om alle sporen van FBS te verwijderen. Voeg vervolgens 0,5 mL menselijk embryonaal stamcelmedium of HES-medium toe dat 10 µM rock-remmer Y 2 7 6 3 2 bevat aan elke put; onderzoek daarna, met behulp van een microscoop gemonteerd in een laminaire flowkast, de herprogrammeringsplaten op de vorming van menselijke iPS-celkolonies.

Verwijder indien nodig de fibroblasten rondom de menselijke iPS-celkolonies met een naald van 21 gauge. Spoel de platen met PBS en voeg vers HES-medium toe dat het TRA 180 1 stain alive specifieke antilichaam bevat. Plaats de cellen terug in de incubator bij 37 °C met 5% CO2.

Vervang na 30 minuten het medium door vers HES-medium aangevuld met 10 micromolair rock-inhibitor. Bekijk vervolgens de kolonies onder de fluorescentiemicroscoop. Markeer 81 TRA1-positieve kolonies.

Snijd de TRA 180 1 positieve menselijke IPS-celkolonies met behulp van een objectmarker en een naald van 21 gauge in verschillende kleine stukjes. Draag vervolgens met een automatische pipet fragmenten van de menselijke IPS-celkolonies over naar individuele putjes van de 24-well plaat met ME Fs. Vermijd het overdragen van niet-IPS-cellen.

Plaats de platen in de incubator en laat de menselijke IPS-celkolonies 24 tot 36 uur hechten, waarbij het medium dagelijks wordt ververst. De menselijke IPS-celkolonies met de juiste HE-achtige morfologie zijn 48 uur na de initiële overplaatsing naar een 24-wellplaat zichtbaar; pas de menselijke IPS-celkolonies elke zes tot acht dagen handmatig over door ze door te snijden met een naald van 21 gauge. Breid de culturen uit naar een 12-wellplaat en vervolgens naar een 6-wellplaat na clonale expansie.

En na het vaststellen van de menselijke IPS-cellijnen wordt de expressie van pluripotentiemarkers TRA-1-60, SSEA-4, T, 3, 4, SOX2 en nanog geanalyseerd met behulp van immunochemie zodra de lijnen zijn vastgesteld. Gedetailleerde karakterisering kan in vitro en in vivo differentieanalyse, karyotype-analyse, analyse van transgeen silencing, methyleringsstudies en genexpressiestudies omvatten.

Efficiënte transductie met retrovirushoudend medium is cruciaal voor succesvolle herprogrammering om de effectiviteit van virale transductie te bepalen. Humane volwassen fibroblasten afgeleid van een patiënt met ziekte van Friedreich werden gevisualiseerd na twee opeenvolgende infecties met GFP-retroviraal medium; wanneer de fibroblasten werden geïnfecteerd door eenvoudige incubatie met viraal medium, is minder dan 20% van de cellen getransduceerd. Echter, wanneer de toevoeging van de GFP-retrovirale media onmiddellijk werd gevolgd door [stapsgewijze interventie], nam de transductie-efficiëntie dramatisch toe.

Hier zijn meer dan 80% van de cellen getransduceerd om een initiële karakterisering van de geïsoleerde menselijke IPS-celkolonies uit te voeren. De expressie van pluripotentiemarkers die kenmerkend zijn voor menselijke ES-cellen werd beoordeeld via immunochemie, zoals hier getoond. Geïsoleerde menselijke IPS-celkolonies waren positief voor de pluripotentiemarkers.

T three four, SOX two, nano SSEA four en TRA one 60 DNA-cos-kleuring met DPI, getoond in de bovenste panelen, wordt gedetecteerd in zowel de menselijke IPS-celkolonies als de feeder-cellen. Deze resultaten tonen aan dat menselijke IPS-cellen, verkregen via dit herprogrammeringsprotocol, de passende pluripotentiemarkers tot expressie brengen die kenmerkend zijn voor ongedifferentieerde menselijke pluripotente stamcellen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u menselijke fibroblasten succesvol kunt herprogrammeren tot pluripotente stamcellen met behulp van retrovirale transductie, hoe u de correcte menselijke geïnduceerde pluripotente stamcelkolonies identificeert en hoe u de initiële karakterisering van hiPSCs uitvoert.