Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van menselijke fibroblasten herprogrammeren met de Stemgent Human TF lentivirus Set

Hoi, mijn naam is Brad Hamilton. Ik ben een wetenschapper hier bij de afdeling Research and Development van STEM Gen. Vandaag laten we u een procedure zien voor het herprogrammeren van menselijke fibroblasten met behulp van herprogrammeringsfactoren die via lentivirussen worden afgeleverd.

Deze procedure kan worden gebruikt om zowel IPS-cellen te genereren als het herprogrammeringsproces te bestuderen. IPS-cellen vertonen gelijkenissen met ES-cellen wat betreft morfologie, proliferatie en het vermogen om te differentiëren naar alle weefseltypen van het lichaam. Humane IPS-cellen hebben een duidelijk voordeel ten opzichte van ES-cellen, aangezien ze de belangrijkste eigenschappen van ES-cellen bezitten zonder het ethische dilemma dat gepaard gaat met het vernietigen van een embryo om de cellen te verkrijgen.

De generatie van patiëntspecifieke IPS-cellen omzeilt een belangrijk obstakel voor gepersonaliseerde regeneratieve geneeskundige therapieën door de mogelijkheid van immuunafstoting van niet-autologe getransplanteerde cellen te elimineren. Laten we beginnen. Op verschillende punten in dit protocol vervangt u het medium van de ontwikkelende IPSC of geïnduceerde pluripotente stamcellen door meth-geconditioneerd medium.

De bereiding van dit medium duurt zes dagen. Begin daarom minstens een week voordat u met uw experiment wilt starten. Begin met het zaaien van elke put van een zes.

Wellplaat met 2 × 10⁵ CFU meth-feeder-cellen in 2 mL meth-groeimedium; incuberen gedurende de nacht bij 37 °C en 5% CO2. Vervang de volgende dag het medium door human E-S-I-P-S celkweekmedium.

Incubeer het medium gedurende de nacht bij 37 °C en 5% CO2. Verzamel het supernatant en vervang dit elke 24 uur door vers medium gedurende vier dagen. Filtreer het supernatant door een 0,22 µm filter.

Vul het verzamelde supernatant aan met 15 nanograms per milliliter BFGF basic fibroblast growth factor. U houdt ongeveer 16 milliliters meth-geconditioneerd medium over; bewaar het supernatant van elke dag afzonderlijk bij vier graden Celsius. Meth-geconditioneerd medium kan één tot twee weken worden bewaard bij vier graden Celsius of enkele maanden bij minus 20 graden Celsius.

Nu u heeft vastgesteld dat uw met meth geconditioneerde medium klaar zal zijn wanneer u het nodig heeft, bespreken we het voorbereiden van de cellen. De eerste taak bij het genereren van iPSC is het gebruik van lentivirussen om menselijke voorhuidfibroblastcellen, of BJ-cellen, te transduceren met vier transcriptiefactoren die kenmerkend zijn voor stamcellen. Ter voorbereiding op de transductie zaait u BJ-cellen met een dichtheid van 1 × 10⁵ cellen per putje van een zes-wells plaat en kweekt u deze.

De cellen in twee milliliters groeimedium worden een nacht lang bij 37 °C en 5% koolstofdioxide gekweekt op dezelfde dag. Begin met het voorbereiden van de feederplaten door twee milliliters 0,1% gelatine, verdund in water, toe te voegen aan een zes-wells plaat en deze een nacht lang te incuberen bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. De gelatine coat de wells en dient als matrix voor de cellen.

Nu zijn de BJ-cellen klaar voor lentivirale transductie om het virus voor transductie voor te bereiden. Vul twee milliliter vers medium aan met zes microgram per milliliter polybrene en vier lentivirussen die elk een van de menselijke transcriptiefactoren tot expressie brengen: Oct4, Sox2, Nanog en Lin28, zodanig dat elk eenzelfde multipliciteit van infectie of MOI heeft.

Deze lentivirussen zijn allemaal inbegrepen in de set lentivirussen voor menselijke herprogrammeringsfactoren. Om de transductie uit te voeren, vervangt u eenvoudig het groeimedium voor BJ-cellen door het medium dat het virus bevat. Schud de plaat voorzichtig heen en weer zodat het medium de bodem gelijkmatig bedekt.

Incubeer gedurende de nacht bij 37 °C en 5% koolstofdioxide op dezelfde dag. Haal één vial cf one meth-feeder-cellen uit de vloeibare stikstof en ontdooi deze. Verwijder de gelatineloplossing uit de meth-feeder-platen, die nu elk zijn gecoat met gelatine.

Voeg 0,2 × 10⁵ cellen toe aan twee milliliter meth-groeimedium. Incubeer het medium een nacht bij 37 °C en 5% CO2. Los de volgende dag de BJ-cellen los met 0,05% trypsine EDTA en centrifugeer bij 200 ×g gedurende vijf minuten.

Zuig na centrifugatie het supernatant af en resuspendeer de cellen in groeimedium. Verwijder het medium uit de meth-feederplaat en voeg twee milliliter BJ-celсусpensie per well toe. De BJ-celconcentratie moet ongeveer vijf keer 10⁴ cellen per well bedragen.

Incubeer overnacht bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. Vervang 24 uur na het zaaien van de BJ-cellen op de meth-feederplaat het medium door menselijk E-S-I-P-S medium, een kweekmedium voor embryonale stamcellen of geïnduceerde pluripotente stamcellen. Ga ermee door het medium elke 24 uur gedurende zeven dagen te verversen.

Vervang op dag zeven het ES-celcultuurmedium door twee milliliters meth-geconditioneerd medium. De meth-feeder-cellen hebben de oplosbare factoren geleverd die nodig zijn voor de groei van IPS-cellen. Nu moeten we echter meer van deze factoren toevoegen om de cultuur gezond te houden.

Meth-geconditioneerd medium bevat alle oplosbare factoren die zijn uitgescheiden door meth-feeder-cellen die gedurende de nacht zijn geïncubeerd bij 37 °C en 5% carbon dioxide. Selecteer via de microscoop een celkolonie. Deze is te herkennen aan een klein, compact koepelvormig uiterlijk in een verse 24-wellplaat die 24 uur voorafgaand is gezaaid met ccf one meth-feeder-cellen; scheid de geselecteerde kolonie uit in een human E-S-I-P-S-cultuur.

Medium aangevuld met 10 µM stammolecuul Y 2 7 6 3 2. Een afhankelijke kinase-remmer. Vervang het kweekmedium elke 24 uur gedurende de eerste zeven dagen, zonder aanvulling van stammolecuul Y 2 7 6 3 2.

Vervang na zeven dagen het medium door meth. Condition medium en ga door met het passeren van de cellen totdat ze een typische morfologie van humane ES-cellen vertonen. Let op kleine, compacte koepelvormige kolonies met een scherpe rand.

De kolonies moeten uniform zijn en een hoge kern-cytoplasmaverhouding hebben. Op dit punt heeft u kolonies ontwikkeld die de morfologie van ES-cellen hebben, maar drukken ze ook genen uit die kenmerkend zijn voor ES-cellen? Om dit vast te stellen, kleurt u de kolonies voor pluripotentiemarkers zoals TRA 180 1, TRA one 60, SSEA four s, SE, a three, T four, sox, two, nanog en SSEA one. Begin hiermee door de cellen voorzichtig drie keer te wassen met PBS.

Fixeer vervolgens de cellen met 500 µL 4% paraformaldehyd of een ander fixatief gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen na 20 minuten nog 3 keer met PBS om overtollig fixatief te verwijderen. Blokkeer vervolgens aspecifieke binding door de cellen gedurende één uur bij kamertemperatuur te incuberen in 500 µL blokkeringsbuffer per well. Voeg na de blokkeringsstap aan elke well 250 µL primair antilichaam toe, verdund 1:100 in blokkeringsbuffer.

Incubeer de cellen gedurende de nacht bij vier graden Celsius in het primaire antilichaam. Was de cellen de volgende dag drie keer met PBS om ongebonden primair antilichaam te verwijderen. Incubeer de cellen gedurende één uur bij kamertemperatuur met 250 µL secundair antilichaam, verdund 1:300 in blokkeringsbuffer, waarbij ze uit het licht worden gehouden om fotobleking na incubatie met het secundaire antilichaam te voorkomen.

Was de cellen drie keer met PBS tot en met de derde wasbeurt. Voeg DPI toe in een concentratie van 1 µg/mL om de kernen te kleuren. Analyseer tot slot de genexpressie van uw iPS-cellen.

Onder de microscoop waren morfologische resultaten zichtbaar bij menselijke huidfibroblasten die waren getransduceerd met OCT4, SOX2, NANOG en LIN28. Morfologische veranderingen werden al waargenomen op dag 4 na transductie en de celclusters werden op dag 17 dichter gepakt. Om de geïsoleerde iPS-celkolonies verder te karakteriseren, hebben we gezocht naar de aanwezigheid van algemene pluripotentiemarkers die tot expressie komen in ES-cellen. De kolonies vertoonden een sterke alkalische fosfatase-activiteit.

Daarnaast werd immunochemie of ICC uitgevoerd op de IPS-celkolonies met een panel van antilichamen specifiek voor pluripotentiemarkers, waaronder oppervlaktemarkers TA 180 1 TRA one 60 SSEA four en SS EEA three, evenals nucleaire markers T four, SOX two en Nanog. De geïsoleerde IPS-kolonies waren positief voor alle markers. De ICC-resultaten laten zien dat de IPS-cellen het juiste expressiepatroon van pluripotentiemarkers vertoonden, wat aantoont dat deze IPS-cellen sterk lijken op ongedifferentieerde humane ES-cellen.

We hebben zojuist aangetoond hoe IPS-cellen kunnen worden gegenereerd door menselijke fibroblasten te herprogrammeren met stamcelgenen. Set lentivirus met menselijke herprogrammeringsfactoren. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om rekening te houden met verschillende factoren.

Ten eerste moet de verhouding tussen het actieve virus en het doelwit mogelijk worden aangepast tijdens de primaire transductiestap om een optimale transductie-efficiëntie te bereiken. Ten tweede kunnen de groeiomstandigheden van de doelcellen een invloed hebben. Gezonde en prolifererende cellen zijn vatbaarder voor herprogrammering.

Ten derde wordt aanbevolen om, bij het aanpassen van het protocol voor verschillende celaantallen, de doelcelaantallen proportioneel aan het oppervlak van de kweekschaal aan te passen. Ten slotte moet het gebruik van ROCK-remmers zoals Y 2 7 6 3 2 worden overwogen om een succesvolle herprogrammering te waarborgen, aangezien recente studies het nut ervan hebben aangetoond bij het verhogen van de overleving van menselijke iPS-kolonies. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.