Herprogrammeren menselijke somatische cellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) Met behulp van retrovirale vector met GFP

Het algemene doel van deze procedure is om menselijke iPS-cellen te genereren via retrovirale overexpressie van OCT4, SOX2, KLF4 en MYC met een GFP-rapportagesysteem. Dit wordt bereikt door eerst de juiste hoeveelheid individueel GFP-exprimerend retrovirus toe te voegen. Vervolgens worden de met het GFP-exprimerende virus geïnfecteerde cellen overgebracht naar platen gecoat met 0,1% gelatine met embryonale muis-fibroblasten.

De derde stap van de procedure is het vervangen van het medium door kweekmedium voor menselijke embryonale stamcellen. Tot slot worden GFP-gestillede IPS-koloniën geïsoleerd die een vergelijkbare morfologie vertonen als menselijke embryonale stamcellen. Uiteindelijk tonen de resultaten de expressie van endogene pluripotentiemarkers via immunofluorescente kleuring en R-T-Q-P-C-R.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals levendskleuring met pluripotente oppervlaktemarkers en het observeren van morfologische veranderingen, is de wenselijke iPad. Celkolonies kunnen eenvoudig worden geïsoleerd door het verlies van GFP-expressie als marker voor de pluripotente cellen te gebruiken om de cultuur te starten. Zaai menselijke fibroblasten in fibroblastmedium één dag voor infectie; breng 1 × 10⁵ menselijke fibroblasten aan in één putje van een zes-wells plaat. Aspireer de volgende dag het medium om dode cellen te verwijderen en voeg 2 mL vers fibroblastmedium toe met 5 µg/mL protaminesulfaat.

Voeg vervolgens zorgvuldig de juiste hoeveelheid van elk GFP-expresserend virus toe, overeenkomend met een multipliciteit van infectie van vijf. Incubeer de cellen gedurende één nacht bij 37 °C na de infectie. Verwijder het virale supernatant en was drie keer met 2 mL PBS.

Voeg vervolgens twee milliliters fibroblastmedium toe, drie dagen na infectie. Controleer de GFP-fluorescentie en vul de well aan met twee milliliters fibroblastmedium. Zaai de volgende dag 1 × 10⁴ per vierkante centimeter bestraalde embryonale muis-fibroblasten of MEF-feeder-cellen in fibroblastmedium uit op een 10 centimeter Petri-schaal die is gecoat met 0,1% gelatine.

Incubeer de cellen gedurende de nacht bij 37 °C. Detacheer de volgende dag de geïnfecteerde menselijke fibroblasten met 1 ml 0,05% tripsine EDTA gedurende vijf minuten bij 37 °C en centrifugeer vijf minuten bij 200 G. Resuspendeer de cellen in 10 ml fibroblastmedium en zaai de cellen uit op vooraf gecoate 0,1% gelatine met mfs. 24 uur later.

Vervang het medium door HESC-kweekmedium en verschoon het medium dagelijks. ESC-achtige kolonies zullen 20 tot 27 dagen na infectie verschijnen, wat onder een fluorescentiemicroscoop zichtbaar zal zijn. Controleer op de afwezigheid van GFP-fluorescentie in een kolonie die een vergelijkbare morfologie vertoont als HSC's.

Gebruik een pipette van 10 µL. Selecteer individuele iPSC-kolonies en plaats deze in één putje van een met gelatine en meth gecoate 12-wells plaat, aangevuld met HESC-medium. Verschoon het medium dagelijks en pas de cellen over door de plaat te wassen met 1 mL DMM F 12.

Voeg vervolgens 0,5 milliliter collagenase toe en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Was de cellen tweemaal met DM A MF 12. Voeg daarna twee milliliter vers HESC-medium toe.

Gebruik vervolgens een cellifter om de kolonies in kleine stukjes op te breken en de resterende cellen van de plaat los te maken. Breng de geresuspendeerde stukjes kolonies over naar één putje van een six-wellplaat die is gecoat met gelatine en MEF, en incubeer deze gedurende twee dagen bij 37 °C.

Om de cellen via immunofluorescentie te controleren: was ze drie keer met PBS en fixeer ze met 4%paraldehyde gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen voorzichtig drie keer met PBS en permeabiliseer ze met 0,2%tritton X 100 in PBS gedurende 30 minuten.

Blokkeer aspecifieke binding door de cellen twee uur lang te incuberen met 3% BSA in PBS. Incubeer de cellen vervolgens gedurende de nacht bij vier graden Celsius met het primaire antilichaam. Was de cellen daarna drie keer met PBS en incubeer ze één uur lang bij kamertemperatuur in het donker met het secundaire antilichaam.

Was de cellen drie keer met PBS tijdens de laatste wasstap. Voeg dappy toe en incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur. Beeld de cellen vast met een fluorescentiemicroscoop voor kwantitatieve realtime-analyse.

PCR-isolatie van totaal RNA uit humane IPC's afgeleid van humane fibroblasten. Gebruik hiervoor een RNA-isolatiekit. Synthetiseer het eerste cDNA-streng met behulp van reverse transcriptase.

Gebruik dit vervolgens als template voor qPCR om pluripotentiegenen te detecteren. Menselijke fibroblasten (BJ), die zijn geïnfecteerd met een cocktail van retrovirussen die OCT4, SOX2, KLF4 en MYC dragen, vertonen hier de morfologische veranderingen die zijn waargenomen tijdens herprogrammering vanaf dag 5. Op dag 10, 14 en 21 beginnen de cellen een hESC-achtige morfologie te vertonen; na 21 dagen worden de iPSC's herkend aan de GFP-fluorescentie.

Pluripotente stamcellen zoals ESC's en IPC's brengen de moleculaire machinerie tot expressie om provirale genexpressie te onderdrukken. De hier gebruikte retrovirale vectoren brengen echter GFP tot expressie samen met herprogrammeringsgenen via de retrovirale LTR. Cellen die GFP continu tot expressie brengen, worden beschouwd als cellen die transgenen tot expressie brengen zonder provirale gensilencing; zoals hier getrouw te zien is, vertonen herprogrammeerde iPSC-koloniën die het Pluripotency Molecular Network hebben verworven, een afwezigheid van GFP-expressie.

Deze figuur toont de immunohistochemische analyse van kolonies afgeleid van Detroit 5 51 fibroblasten met antilichamen tegen TRA 180 1, TRA one 60 SSEA four T four en nano, zoals succesvol kan worden waargenomen. Hergeprogrammeerde IPC's brengen al deze markers tot expressie. Daarnaast werd kwantitatieve R-T-P-C-R uitgevoerd om de genexpressie te analyseren, waaruit bleek dat T four SOX two, KLF four M en nano significant verhoogd waren in vergelijking met de ouderlijke fibroblastcellen, maar in overeenstemming waren met die van H nine HSC's.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u het virus infecteert, en hoe u de volledig lip-geprogrammeerde IPA-cellen identificeert en opvangt met behulp van fluorescentiemicroscopie.