RNAi screening Postembryonic fenotypes Leg in C. elegans

Het doel van deze procedure is om post-embryonale regulatoren van eiwitexpressie en lokalisatie in C. elegans te identificeren met behulp van een RNAi-gebaseerde genomische screening en fluorescentie-gelabelde eiwitten. Zodra de geschikte screeningsstam is geconstrueerd, wordt een RNAi-bibliotheek gekozen. De eerste stap van de procedure is het verpakken van de bibliotheekklonen in bacteriën.

De bacteriën worden vervolgens geselecteerd, opgekweekt en gevoerd aan C. elegans-nematoden in diverse stadia. Nadat de nematoden 72 uur lang zijn doorgegroeid, worden ze geobserveerd op veranderingen in het fenotype van belang. Tot slot worden veranderingen in de expressie of subcellulaire lokalisatie van het getargete eiwit gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie.

Deze methode kan genen identificeren die vereist zijn voor de juiste subcellulaire lokalisatie van een fluorescent gelabeld eiwit. Echter kan dit protocol worden aangepast om genen te identificeren die andere post-embryonale fenotypes van belang beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande gepubliceerde protocollen is dat wij de consistentie en het niveau van de RNAi-respons in dieren hebben geoptimaliseerd door de productie van het dubbelstrengs RNA in bacteriën te induceren vóór het uitplaten.

De procedure wordt gedemonstreerd door Kathy Fuss, onderzoeker uit mijn laboratorium. Bereid de kloonbibliotheek voor binnen twee maanden na de start van het experiment; strijk eerst bacteriën van geselecteerde feeding library-klonen, evenals positieve en negatieve controles, uit op LB-platen met tetracycline. Gebruik als positieve controle een kloon die een gen bevat dat een dosisafhankelijk post-embryonale fenotype produceert, zoals BLE four. Gebruik als negatieve controle een lege vector of een kloon die een voorspeld pseudogen bevat zonder waargenomen fenotypes.

Incubeer de platen overnacht. Inoculeer voor elke kloon twee milliliter LB-medium dat 50 µg/mL carbenicilline bevat met een enkele kolonie van de uitstrijkplaten. Incubeer de culturen overnacht onder agitatie. De volgende ochtend moeten de oplossingen troebel zijn. Induceer de productie van dubbelstrengs RNA door IPTG aan de culturen toe te voegen en incubeer deze nog vier tot vijf uur onder dezelfde omstandigheden.

Het toevoegen van IPTG zorgt voor een consistenter en robuuster RNAI-geïnduceerd knockdown van het genproduct dan wanneer men uitsluitend vertrouwt op het IPTG en de auger van de NGM-plaat. Na de IPTG-incubatie worden 30 µL cultuur van elke kloon in elke put van de voorbereide 24-wells NGM RNAi-platen gespot. Eén kloon per put. Elke plaat moet twee putten bevatten die zijn bestemd voor de controles.

Markeer zorgvuldig de locatie van elke bibliotheek. Kloon in de 24-wells platen en plaats de platen vervolgens onafgedekt in een steriele laminaire flowkast om ongeveer 20 minuten te drogen. Zorg ervoor dat de randen van de agar niet loslaten van de plaat.

Zodra de gestageerde nematoden op de plaatjes zijn gedroogd, worden de instructies voor de preparatie van de nematoden gegeven. Begin in de volgende sectie met een gestageerde populatie van nematoden in het eerste larvale stadium of L1-nematoden. Door te beginnen met L1-larven worden potentiële embryonale letale fenotypen omzeild.

Het gebruik van een populatie dieren in verschillende stadia voor screening vergroot bovendien het vertrouwen dat eventuele waargenomen variaties het gevolg zijn van de RNAi en niet simpelweg normale variaties zijn die in verschillende stadia voorkomen. Indien de RNAi echter een ontwikkelingsvertraging veroorzaakt, dient dit door de screener te worden genoteerd. Bleek een populatie van de screeningsstam in verschillende stadia.

Alleen embryo's die door het eierschaal beschermd worden, zullen deze stap overleven; de dieren bereiken het stadium binnen 12 uur indien dit bij 20 °C wordt uitgevoerd, of binnen 18 uur indien dit bij 16 °C gebeurt op de dag dat de bacteriële culturen worden geïnoculeerd. Selecteer drie platen van 100 millimeter met dieren van de screeningsstam die gezond zijn en zowel drachtige volwassenen als embryo's bevatten.

Was alle dieren in steriel M9-medium en breng het waswater over naar een steriele buis van 15 milliliter met schroefdop. Als het wasvolume groter is dan 3,5 milliliter, centrifugeer de dieren dan en verwijder alle vloeistof behalve 3,5 milliliter. Als het volume minder is dan 3,5 milliliter.

Verhoog het volume tot 3,5 milliliters met water of M negen om de embryo's van de volwassen dieren te scheiden met 1,5 milliliters van een mengsel van natriumhydroxide en bleekmiddel per wasbeurt. Laat de dieren maximaal 10 minuten incuberen in deze oplossing. Start een timer, vortex elke buis gedurende 10 seconden en herhaal het vortexen elke twee minuten.

Observe na elke vortexbehandeling de oplossing onder een dissectiescoop om te controleren op karkassen van dieren. Binnen zes tot acht minuten zullen de volwassenen gefragmenteerd zijn en zouden de embryo's vrij moeten komen. Verwijder de embryo's uit de bleekoplossing door ze te pelleten en zoveel mogelijk van het supernatant te verwijderen zonder de pellet te verstoren.

Resuspendeer vervolgens het pellet in een volume van 10 milliliters door steriel M nine toe te voegen en te agiteren. Herhaal dit wasproces ten minste nogmaals totdat de geur van bleek volledig ondetecteerbaar is. Om de dieren nauwkeuriger te faseren, kunnen ze in het L1-stadium worden vastgezet door embryo's uit te laten komen in M nine-medium zonder voedsel.

Dit wordt gedaan door de embryo's in M nine over te brengen naar een kleine erlenmeyer. Schud de kolf gedurende de nacht bij de juiste temperatuur voor de stam en het experiment. Gedurende deze tijd zullen de dieren allemaal uitkomen en de volgende dag tot rust komen in de L one-diapauze.

Zet de groei van de larven voort vanaf een vastgelegd tijdstip door ze over te brengen naar de voorbereide bacteriën die dubbelstrengs RNA tot expressie brengen. Dit is dezelfde dag waarop de 24-wells platen zijn geënt met bacteriën. Begin met het overbrengen van de L1-dieren naar een buisje van 15 milliliter en centrifugeer ze naar beneden. Concentreer de dieren vervolgens in een halve tot één milliliter M9 en breng vijf microliters van de geconcentreerde nematoden aan op een plaat.

Tel het aantal dieren op de plaat en pas de geconcentreerde nematode-oplossing aan. Er moeten 30 wormen aanwezig zijn per drie tot 10 µL. Spot ten slotte ongeveer 30 L1-stadium dieren op de bacteriën in elke put van de voorbereide plaat.

Bij een 24-wells plaat kan meer dan 30 dieren per well leiden tot uithongering. Nadat de vlekken zijn opgedroogd, wat enkele minuten duurt, wordt het deksel met het elastiekje vastgezet. Incubeer de dieren ondersteboven bij de vereiste temperatuur en duur om de dieren in het gewenste stadium te scoren. Zodra de nematoden klaar zijn voor screening, dient te worden bevestigd dat de positieve en negatieve controles de verwachte fenotypes vertonen. Observeer vervolgens de experimentele dieren op ontwikkelingsafwijkingen.

Monteer vervolgens met behulp van een dissectiemicroscoop acht tot 12 dieren uit elke put op 4% Agri PET-preparaatjes met een druppel van vijf microliter anestheticum. Breng na het aanbrengen van het passende dekglas observaties uit van ten minste vijf dieren uit met behulp van een lichtmicroscoop. Houd een georganiseerde database bij van het gen, het aantal geobserveerde dieren en de fenotypische resultaten.

Verifieer voor elk RNAi-experiment het geproduceerde RNAi-fenotype indien mogelijk met een ander secundair fenotype en door het experiment te herhalen; voor herhaalde experimenten kan gebruik worden gemaakt van bacteriën van dezelfde uitstrijk. Oudere uitstrijken kunnen leiden tot een slechte groei in overnight vloeibare culturen en moeten daarom eerst opnieuw worden uitgestreken. Sommige bacteriële culturen zullen niet goed groeien vanwege het genproduct dat in hun plasmide tot expressie komt.

In dit geval kunnen de bacteriën simpelweg geconcentreerd worden vóór het uitplaten. Voor een doorlopende screening is het belangrijk om altijd voldoende embryo's gereed te hebben voor de stadiumbepaling. De screeningsstam moet altijd gevoed worden, niet uitgehongerd, en vrij zijn van contaminanten die het phenotype van belang kunnen beïnvloeden.

We hebben een onderhoudsschema opgesteld voor het voeren van de dieren. Genen die de lokalisatie van DBL one beïnvloeden, werden geïdentificeerd via RNAi met behulp van een specifiek ontworpen stam voor deze screening. De normale expressie van de GFP-tag dbl one omvat de cellichamen van het ventrale zenuwstelsel en een rij puncta bij dieren die antisense RA tegen DBL kregen toegediend.

Eén mRNA vertoonde een ernstig verminderde expressie van DBL one. Deze dieren waren ook klein, net als dieren die geen functioneel DBL L one bezitten. De RNA I-screening identificeerde succesvol veel andere genen waarvan de producten de lokalisatie van DBL one beïnvloeden, waardoor ons begrip van hoe TGF beta subcellulair wordt getransporteerd is uitgebreid en er een uitgangspunt is gecreëerd voor veel verdere onderzoeken.

Met deze methode kan één persoon redelijkerwijs wekelijks twee tot vier series experimenten opzetten en observeren. Zo kunnen dieren die op maandag en dinsdag zijn klaargezet, respectievelijk op donderdag en vrijdag worden geobserveerd, waarna er op vrijdag en zaterdag opnieuw dieren klaargezet kunnen worden voor de maandag en dinsdag. Observatie terwijl u deze procedure gedurende uw screening volgt.

Het is belangrijk om voldoende embryo's klaar te hebben voor de stadiëring, dus houd de screeningsstam regelmatig in stand. Daarnaast is het belangrijk om gedetailleerde aantekeningen te maken van alle observaties.