Een kwantitatieve analyse Fitness Workflow

Het doel van deze procedure is om kwantitatieve microbiële kweekfitnessen parallel op genoombrede schaal op een nauwkeurige en high-throughput manier vast te leggen. Dit wordt bereikt door eerst een array-bibliotheek van microbiële kolonies in 96-wells platen op te zetten en de kweek tot verzadiging te laten groeien. Vervolgens worden de verzadigde kweken verdund in water en daarna op vaste agaplaatjes gespot.

Vervolgens worden de vaste agarplaten periodiek gefotografeerd totdat de groei van de microbiële kolonie is verzadigd. Ten slotte worden de tijdreeksfoto's van de groei van elke cultuur omgezet in kwantitatieve maten van de celdichtheid, en worden de waargenomen groeicurves samen met groeimodellen en kwantitatieve maten van de microbiële fitness samengevat. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die bewijs leveren voor genetische interacties door aan te tonen dat microbiële stammen verschillende fitnesses vertonen, hetzij wanneer ze worden gecombineerd met verschillende mutaties, of wanneer ze onder verschillende condities worden gekweekt.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals methoden voor pinning met een hoge dichtheid zoals SGA of barcode-competitie-experimenten, is dat fitnessmetingen nauwkeuriger zijn. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de ontwikkeling van kankermedicijnen, zoals welke genen en processen belangrijk zijn bij de respons op DNA-schade en celcycluscontrole, en het begrijpen en vertalen van dergelijk onderzoek naar basismicroorganismen in de vorm van potentiële drugstargets in menselijke kankercellen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in telomeerfunctie en visi.

Het kan ook worden toegepast op andere gebieden binnen de gistbiologie of op elk gebied waar fitnessfenotypes inzicht kunnen bieden in de microbiële biologie. We hopen dat QFA kan worden toegepast op veel andere microbiële organismen waarvoor array-bibliotheken bestaan. Bijvoorbeeld, povi e coli, orilla surplus. Beginnend met verzadigde overnight-culturen werden tot 96 onafhankelijke giststammen uitgeplaat in volumes van 200 µL rijk vloeibaar medium.

Steriliseer in een 96-well kweekplaat een handmatige replica-plater met 96 pinnen en een diameter van een achtste inch door deze eerst in 100% ethanol te dopen, vervolgens te vlammen en te laten afkoelen. Breng 200 µL steriel water aan in de wells van een 96-well plaat. Vortex de verzadigde gistculturen en verdun deze door de gesteriliseerde pin-tool drie keer in de stammen te dopen. Doop de tool vervolgens één keer in de plaat met water. Steriliseer de pin-tool opnieuw en laat deze afkoelen voordat u deze drie keer in de verdunde culturen doopt. Draag de pinnen vervolgens over naar een vaste agarplaat.

Gebruik na incubatie van de agarplaten een s and p robotics SP imager om deze handmatig te fotograferen voor geautomatiseerde cultuur. Begin met een rechthoekig raster van onafhankelijke giststammen die zijn gegroeid op vaste agar. In dit voorbeeld zijn de startstammen het resultaat van een kruising tussen een temperatuurgevoelige query-mutatie en de yeast deletion collection.

1.536 culturen, die vier replica's van 384 onafhankelijke giststammen vertegenwoordigen, worden gekweekt op SGA-platen met behulp van een robot met een steriel 96-pins instrument met een pin diameter van één millimeter. Draag 384 van de 1.536 stammen over naar 4 culturenplaten van 96 wells die 200 µL selectief medium bevatten en kweek de culturen bij 20 °C tot verzadiging. Om de verzadigde gistculturen te spotten, begint u met het overbrengen ervan naar een liquid-handling robot en het resuspenderen op een magnetische schudplaat. Verdun de culturen tot ongeveer 1:70 door met een steriel robotisch 96-pins instrument te pinnen in 200 µL steriel water.

Spot na het reinigen en steriliseren van het pin-instrument de verdunde culturen op agarplaten. Breng de platen in een 384-well formaat over naar een temperatuurgecontroleerde, bevochtigde incubator met een automatische carrousel en toegangsluik. Gebruik voor het afbeelden van de culturen een robotische automatische imager, die de platen herhaaldelijk uit de incubator haalt, de deksels verwijdert, ze overbrengt naar een uniform verlichte ruimte onder een 35 millimeter camera en een afbeelding vastlegt met een resolutie van 5.184 bij 3.456.

Pixel resolution plaatst het deksel terug en zet de platen vervolgens terug in het carrousel van de incubator om de locaties van de culturen op de platen en de toegepaste behandelingen bij te houden. Platen worden automatisch voorzien van een streepjescode op basis van de naam van de incubator, de temperatuur, een uniek opeenvolgend batchnummer en de positie in de incubator. De namen van de afbeeldingen zijn een samenvoeging van de plaatnaam en het tijdstip en worden automatisch gegenereerd bij het vastleggen van de afbeelding.

Platen worden vaak ook handmatig gelabeld om er zeker van te zijn dat ze in dezelfde volgorde blijven bij het overbrengen tussen robotcarrousels. De metadatabestanden zijn tabgescheiden tekstbestanden, die handmatig worden gegenereerd. Het bestand met de experimentele beschrijving FT twee.

Tabel één is uniek voor elk experiment, maar de bibliotheekbeschrijving FT drie, tabel één kan uitgebreid worden hergebruikt. Eenmaal geconstrueerd, wordt het experiment beschreven in het bestand met de experimentele beschrijving FT twee tabel één, dat kolommen bevat voor de barcode of automatisch gegenereerde plaatnaam, het starttijdstip van het experiment, de plaatbehandeling, de inhoud van het vaste agarmedium, de schermnaam, het bibliotheekplaatnummer voor bibliotheken met meerdere platen, en een herhalingskwadrantnummer voor het schalen van een 1.536-well formaat naar een 384-well formaat. De e-stammenbibliotheek wordt beschreven met een bibliotheekbeschrijvingsbestand FT drie, tabel één, waarin het genotype wordt vermeld dat in elke cultuurlocatie is gekweekt.

Elke plaat in een bibliotheek bevat vier kolommen: bibliotheeknaam, ORF, plaatnummer, rij en kolom van de plaat, en een optionele kolom voor opmerkingen. Een optioneel bestand met standaard gennamen kan worden verstrekt (tabel 1), waarin de standaard gennaam wordt beschreven die geassocieerd is met elk systematisch ORF-nummer, ter identificatie van de gescreende stammen. Voor de analyse van de gegevens bevat dit bestand twee kolommen: ORF en gennaam.

De computationele workflow voor QFA vereist toegang tot een redelijk krachtig multi-core computerworkstation waarop de software is geïnstalleerd. De softwaretool Colonizer voor beeldanalyse en het QFAR-pakket, die beide online gedocumenteerd zijn, zijn gratis beschikbaar en werken op diverse besturingssystemen. Voer Colonizer uit met elke vastgelegde plaatafbeelding als input, waarbij één Colonizer-outputbestand (FT five, tabel 1) per vastgelegde afbeelding wordt gegenereerd. De Colonizer-outputbestanden specificeren schattingen van de culturedichtheid, het cultuuroppervlak, de vorm en de kleur.

Voor elk van de 384 locaties op de beeldplaat wordt een outputbestandsnaam automatisch gekopieerd van de bestandsnaam van het bronbeeld. Het QFAR-pakket bevat functies om tijdreeksen voor elke cultuur te selecteren om gegeneraliseerde logistische populatiemodellen op waarnemingen aan te passen en te plotten. Zie voorbeelden in figuur twee en drie.

De gefitte parameterwaarden worden weggeschreven naar QFA-logistische parameterbestanden. Het QFAR-pakket bevat tevens functies voor kwaliteitscontrole. Randkolonies worden verworpen vanwege de grotere beschikbaarheid van voedingsstoffen aan de randen van de plaat en moeilijkheden bij de beeldanalyse.

Kweken nabij de wanden van de plaat, kweken die niet voldeden aan de SGA en genotypen die koppeling vertoonden met screenspecifieke markergenen worden uit de analyse verwijderd. Voor elke kweek worden verschillende kwantitatieve fitnessmaten afgeleid uit parameters van het logistische populatiemodel. Deze omvatten de maximale populatieverdubbelingssnelheden en het aantal delingen van inoculatie tot verzadiging voor elke set van herhaalde kweken en voor elke definitie van fitness.

Verschillende samenvattende statistieken van de fitnessschattingen worden berekend: de gemiddelde en mediane fitness, de standaardafwijking van de fitness en het aantal waargenomen replica's. De samenvattende statistieken worden geëxporteerd naar QFA-fitnesssamenvattingsbestanden FT acht, tabel 1 voor verdere analyse. Voorbeelden hiervan zijn berekeningen van genetische interactiescores FT negen tabel 1.

Deze figuur toont één typische groeicurve op een logaritmische schaal uit 384 QFA. Culturen die groeien bij 20 °C op vaste agar, zoals gekwantificeerd door colonizer, waarbij een toename in celdichtheid voor het eerst detecteerbaar is na ongeveer twee dagen. Deze vertraging is waarschijnlijk een gecombineerd effect van een lag-fase van de cultuur na inoculatie op een vast medium en een lagere detectielimiet voor celdichtheid.

Hier zijn 308 vergelijkbare groeicurves vastgelegd van één enkele plaat. Let erop dat stammen die een vlakke lijn produceerden, zeer ziek of dood waren. Deze figuur toont de vergelijking van twee genoombrede QFA-screens om genetische interactiesterktes af te leiden.

Het QFAR-pakket bevat ook functies om de voorgaande groeicurve-figuur te genereren en om gerangschikte lijsten van onderzochte genotypen en schattingen van de sterkte van de genetische interactie uit te voeren. Samen met een Q-waarde voor de significantie van de waargenomen GIS kan, zodra men de methode beheerst, een volledig genoombreed QF.A-experiment met vier replica's binnen drie weken worden voltooid. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om georganiseerd te blijven bij het bijhouden en benoemen van alle platen en afbeeldingen.

Alle platen moeten worden geïnoculeerd en in de juiste oriëntatie en volgorde worden gespot. De data-analyse is afhankelijk van de correctheid van de aanvullende tekstbestanden die door de experimenteel wetenschapper zijn opgesteld. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de fitness van duizenden onafhankelijke microbiële culturen kan worden geschat.

De fitness wordt geschat door herhaaldelijk foto's te maken van gespotte culturen die groeien op vaste agarplaten, waarbij de vastgelegde beelden worden omgezet in schattingen van de celdichtheid en groeicurves worden gegenereerd. Mathematische modellering van groeicurves levert kwantitatieve fitnessschattingen op, die vervolgens kunnen worden gebruikt om functionele relaties tussen genproducten op genoombrede schaal af te leiden.