Chromosomics: Detectie van numerieke en structurele veranderingen in alle 24 menselijke chromosomen tegelijk met behulp van een roman OctoChrome FISH-test
6 februari 2012
Een nieuwe fluorescentie In situ Hybridisatie (FISH) methode die gelijktijdig onderzoekt zowel numerieke en structurele chromosoom veranderingen, name de specifieke chromosomale translocaties geassocieerd met leukemie en lymfoom, van alle 24 menselijke chromosomen op een enkel apparaat in een hybridisatie wordt beschreven.
De Octa Chrome Fish-assay onderzoekt gelijktijdig alle 24 menselijke chromosomen in een enkele hybridisatie op één objectglas. Bereid eerst metafase-spreidingen voor op het specifieke objectglas met acht vierkanten. Voer vervolgens een geautomatiseerde scan van het monsterglas uit om de lokalisatie van alle metafases en de toekomstige herevaluatie van alle celbeelden te vergemakkelijken.
Plaats vervolgens het objectglas met acht vakken over het Octa chrome-apparaat en hybridiseer de probes. De verkregen resultaten kunnen drie verschillende geschilderde hele chromosomen in elk vak tonen, gebaseerd op de rangschikking van chromosoomcombinaties op het RO-apparaat. Ik kreeg voor het eerst het idee voor deze RO FISH-methode toen ik aan het begin van de jaren 90 FISH begon toe te passen in studies naar humane populaties.
Vervolgens introduceerde ik mijn idee van drievoudige kleuringsschildering, acht vierkante coupes om de cel vast te leggen, tijdens de jaarlijkse A A CR-conferentie in 1994. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals klassieke chromosoombuiging en moderne spectrale prototyping, is dat het probleemloos alle 24 menselijke chromosomen in een groter aantal cellen kan analyseren. Begin met een preparaat van metafasecellen gefixeerd in suspensie als controle; breng een pipetdruppel cellen aan op een objectglas en controleer of de dichtheid passend is.
Dip nu in acht vierkante OC-chroom en schuif dit gedurende twee minuten in zuivere ethanol. Verdeel vijf microliter celisuspensie in een reeks afwisselende vierkanten op de objectglasplaat om te voorkomen dat de celuitstrijkjes elkaar beïnvloeden. Laat de monsters aan de lucht drogen voordat de aangrenzende paren worden aangebracht.
Breng 20 µL van 0,2 µg/mL DAPI-kleuring aan in het midden van elk half deel van het preparaat en plaats een dekglas. Voer nu een automatische scan van het monsterpreparaat uit om de metafasecellen te lokaliseren. Gebruik metaverse-software om de lokalisatie van alle metafasen en de toekomstige herbeoordeling van alle celbeelden te vergemakkelijken.
Bekijk de scanresultaten handmatig en verwijder artefacten die geen metafasen zijn. Verwijder eerst de DPI-kleuring in twee XSSC-buffer en dehydrateer de monsters vervolgens via een reeks ethanolwasbeurten. Laat de slide aan de lucht drogen en plaats deze daarna vijf minuten op een warmteplaat van 37 °C.
Equilibreer nu de chroma-probe, de hybridisatiekamer voor meerdere probes en de hybridisatiebuffer in een waterbad van 37 °C met de labelzijde naar beneden. Plaats het OC-chromato-apparaat op een warmteplaat van 37 °C. Voeg twee µL voorverwarmde hybridisatielosutie toe aan elk van de acht gebieden.
Keer het template voorzichtig om en richt het correct uit. Schuif het over het OC chrome-apparaat. Verifieer dat het template-plaatje is uitgelijnd met het Octa Chrome-apparaat.
Laat vervolgens het objectglas voorzichtig op de druppels hybridisatie-oplossing zakken en oefen een zachte, gelijkmatige druk uit om de hybridisatie-oplossing tot aan de randen van elk van de verhoogde gebieden op het OC-chroomapparaat te verspreiden. Til het objectglas op bij het gematteerde uiteinde en draai het om, zodat het objectglas zich onder het OC-chroomapparaat bevindt. Plaats dit gedurende 10 minuten op een warmteplaat van 37 degree Celsius.
Plaats het vervolgens vijf minuten op een warmteplaat van 75 °C. Om de monsters te denatureren voor de hybridisatiestap, worden deze overgebracht naar een chroma probe multi-probe hybridisatiekamer. Plaats het deksel terug en laat de kamer gedurende de nacht drijven in het waterbad van 37 °C.
Verwijder het objectglas voorzichtig uit het apparaat en was dit in 0.4 overmaat SC bij 72 °C gedurende twee minuten. Voer de tweede wasbeurt uit bij kamertemperatuur gedurende 30 seconden. Voeg vervolgens 20 µL DPI toe aan het midden van elk halve deel van het objectglas en plaats een dekglas.
Incubeer de monsters 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur voordat ze met fluorescentiemicroscopie worden bekeken. De Octa chrome fish assay maakt gelijktijdige examinatie van alle 24 menselijke chromosomen mogelijk met behulp van één enkele hybridisatie op één enkel objectglas. Elk vierkant bevat drie verschillende whole chromosome painting probes die direct zijn gelabeld met verschillende gekleurde fluoro.
Onderzoek van een normale metafasecel in vierkant twee van het Octa CHRO-systeem laat zien dat chromosomen 8, 21 en 12 rood, groen en blauw zijn gekleurd. Ze kunnen individueel worden gevisualiseerd met de respectievelijke filters of gelijktijdig worden gevisualiseerd via een DAPI Fitzy, Texas Red triple filter. Deze chromosomale benadering is nuttig voor de detectie van abnormale cellen met leukemie-specifieke chromosomale translocaties en aneuploïdie.
Bijvoorbeeld, T 8 21 is een veelvoorkomende chromosomale translocatie bij acute myeloïde leukemie. Trisomie 21 (3 kopieën van chromosoom 21) is een veelvoorkomende aneuploïdie bij leukemie na de ontwikkeling. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor wetenschappers op het gebied van de moleculaire cytogenetica en moleculaire epidemiologie om de meest voorkomende chromosomale herschikkingen te onderzoeken die worden aangetroffen bij leukemie en lymfoom, en om selectieve ploidie te bestuderen onder alle menselijke chromosomen bij klinische patiënten of populaties die zijn blootgesteld aan toxische chemicaliën.
Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe alle 24 menselijke chromosomen gelijktijdig in een enkele hybridisatie op één objectglas kunnen worden onderzocht met de Octo Chrome Fish-assay. En we definiëren dit als chromosomen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een nieuwe methode voor fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), bekend als de Octa Chrome Fish-assay. Deze methode maakt het mogelijk om alle 24 menselijke chromosomen gelijktijdig te onderzoeken in één enkele hybridisatie op één objectglas, met de focus op chromosomale afwijkingen die geassocieerd worden met leukemie en lymfoom.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH)
- Chromosoomanalyse
- Oncologie
Achtergrond
- FISH is een techniek die wordt gebruikt om de aanwezigheid of afwezigheid van specifieke DNA-sequenties op chromosomen te detecteren en te lokaliseren.
- Chromosomale translocaties zijn van groot belang bij de studie naar leukemie en lymfoom.
- De methode maakt een uitgebreide analyse van chromosomale veranderingen mogelijk.
- Eerdere methoden vereisten meerdere hybridisaties, waardoor deze aanpak efficiënter is.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode die de detectie van chromosomale afwijkingen vereenvoudigt.
- Het verhogen van de efficiëntie van chromosomale analyse in klinische omgevingen.
- Het bieden van een instrument voor een beter begrip van de genetische basis van hematologische maligniteiten.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van metafase-preparaten op een gespecialiseerde slide met acht vakken.
- Geautomatiseerde scanning van de slide om metafasen voor analyse te lokaliseren.
- Hybridisatie van probes met behulp van het Octa Chrome-apparaat.
- Visualisatie van de resultaten, waarbij verschillende geschilderde volledige chromosomen worden getoond op basis van hun rangschikking.
Belangrijkste resultaten
- De assay visualiseert succesvol alle 24 chromosomen in één enkele hybridisatie.
- Resultaten kunnen drie verschillende geschilderde chromosomen weergeven in elk vak van het preparaat.
- Faciliteert de herbeoordeling van celbeelden voor een uitgebreide analyse.
- Demonstreert het potentieel voor toepassing in studies naar menselijke populaties.
Conclusies
- De Octa Chrome Fish-assay vertegenwoordigt een belangrijke vooruitgang in de FISH-methodologie.
- Deze methode kan de detectie van chromosomale abnormaliteiten bij hematologische kankers verbeteren.
- Het biedt een efficiëntere aanpak voor onderzoekers en clinici.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
De OctoChrome-FISH-assay maakt de gelijktijdige detectie van numerieke en structurele chromosomale afwijkingen mogelijk over alle 24 menselijke chromosomen in een enkele hybridisatie, waarmee een belangrijk knelpunt in de cytogenetische analyse van hematologische maligniteiten wordt weggenomen. Door whole-genome screening te consolideren in één workflow op basis van één objectglas, wordt de doorvoer en reproduceerbaarheid in leukemie- en lymfoomonderzoek verhoogd, wat vroege targetvalidatie en mechanistische risicoreductie in preklinische discovery ondersteunt. Deze mogelijkheid verbetert het voorspellend vertrouwen bij het identificeren van translocatie-gedreven oncogenen en aneuploidiepatronen die relevant zijn voor benzeen-geïnduceerde leukemogenese en blootstelling aan andere toxische stoffen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door leukemie-specifieke translocaties zoals t(9;22), t(15;17), t(8;21) en t(14;18) te visualiseren in hun natuurlijke chromosomale context.
- Operationele waarde: Vermindert de noodzaak voor meerdere opeenvolgende FISH-hybridisaties, waardoor monsters worden bespaard en de bevestiging van targets in discovery biology wordt versneld.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door gelijktijdige beoordeling van structurele herschikkingen en genoombrede aneuploïdie, wat het vertrouwen in associaties tussen target en ziekte vergroot.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde chromosomale systemen voor op downstream screening door baseline karyotypen vast te stellen en achtergrondveranderingspercentages in blootgestelde populaties te detecteren.
- Operationele waarde: Standaardiseert cytogenetische read-outs door consistente probe-labeling en slide-architectuur, wat de reproduceerbaarheid tussen laboratoria en screeningcampagnes verbetert.
- Schaalbaarheidswaarde: Maakt high-content analyse van metafase-spreidingen mogelijk via geautomatiseerd scannen, wat herbeoordeling en longitudinale tracking van chromosomale stabiliteit in longitudinale toxicologiestudies faciliteert.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Slaat een brug tussen ontdekking en preklinische validatie door een directe vergelijking mogelijk te maken van chromosomale veranderingen in celmodellen, patiëntmonsters en populatiecohorten die zijn blootgesteld aan leukemogenen zoals benzeen.
- Mechanische risicoreductie: Verduidelijkt of waargenomen aneuploidieën of translocaties willekeurige gebeurtenissen zijn of patronen die aan blootstelling zijn gekoppeld, wat bijdraagt aan de risicobeoordeling bij de ontwikkeling van translationele biomarkers.
- Continuiteitswaarde: Ondersteunt een naadloze overgang van in vitro bevindingen naar in vivo relevantie door de chromosomale resolutie consistent te houden over modelsystemen en menselijke specimens.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het continuüm van ontdekking tot preklinische fase, waardoor chromosomale analyse mogelijk is in vroege stadia van hypothesetoetsing en ondersteuning wordt geboden bij de identificatie van lead-verbindingen door mechanistische risicoreductie van genomische instabiliteit.
- Discovery Biology: Faciliteert het testen van hypothesen over chromosomale mechanismen bij leukemogenese door gelijktijdige screening van meerdere bekende en nieuwe alteraties over het gehele genoom mogelijk te maken.
- Screening: Levert kwantitatieve, gemultiplexte output (bijv. translocatiefrequentie, aneuploidiegraden) waardoor effecten van verbindingen of blootstellingen tussen verschillende condities kunnen worden vergeleken.
- Analytics: Genereert gemultiplexte fluorescentie-uitlezingen die compatibel zijn met geautomatiseerde beeldvorming en software-ondersteunde karyotypering, wat een objectieve vergelijking van chromosomale toestanden mogelijk maakt.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in vitro bevindingen met menselijke relevantie door identieke chromosomale patronen te detecteren in populatiestudies, wat de afstemming van biomarkers ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Fungeert als een herbruikbaar cytogenetisch platform dat toepasbaar is binnen oncologie-, toxicologie- en farmacogenomica-programma's waarbij beoordeling van de chromosomale integriteit vereist is.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in targetvalidatie door fout-negatieven te verminderen via een volledige chromosomale dekking.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde probesets en objectglasformaten, waardoor interlaboratoriumvariabiliteit wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verhoogt de kapitaalefficiëntie door het verbruik van reagentia en de actieve tijd te verminderen in vergelijking met sequentiële FISH- of SKY-benaderingen.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde beslissingen over voortgang mogelijk door vroegtijdig bewijs te leveren van genomische stabiliteit of instabiliteit in leidende kandidaten.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in fluorescentiemicroscopie en cytogenetische preparatie voor het nauwkeurig genereren van metafase-spreidingen en de interpretatie van signalen.
- Afhankelijk van toegang tot het OctoChrome-apparaat en compatibele hybridisatiekamers voor de simultane afgifte van meerdere probes.
- Vereist standaardisatie van de protocollen voor het hanteren van coupes, denaturatie en wassen om een consistente penetratie van de probe en signaal-ruisverhoudingen te waarborgen.
- Aanpassing aan niet-menselijke modelsystemen kan revalidatie van de probe-specificiteit en de efficiëntie van de chromosomale painting vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de afhankelijkheid van monsters van metafase-kwaliteit en potentiële signaaloverlap in sterk gerearrangeerde genomen, wat zorgvuldige spectrale ontmenging vereist.
