Chemisch-geblokkeerde Antilichaam Microarray voor multiplexverzending High-throughput Profilering van specifiek eiwit glycosylering in Complex Samples

Dit videoartikel beschrijft een procedure voor het verkrijgen van glycosyleringsprofielen van 20 verschillende glycoproteïnen in een serummonster van een patiënt met hepatocellulair carcinoom met behulp van een chemisch geblokkeerde antilichaam-microarray. Eerst worden glycoproteïnespecifieke antilichamen direct op microarray-slides geprint en worden de glycanen van de antilichamen geblokkeerd om lectinebinding te voorkomen. Wanneer patiëntserummonsters worden aangebracht, worden de glycoproteïnen uit het monster gevangen door de antilichamen. Biotinylated glycaanbindende eiwitten worden vervolgens toegevoegd om de glycanen te detecten, waarna digeconjugeerd neutravidin wordt toegevoegd om de gebiotinyleerde lectines te labelen.

De microarray-dia wordt vervolgens gescand om fluorescentie te detecteren; de analyse van de resulterende gegevens onthult de glycosyleringsprofielen van de eiwitten in het monster. Deze techniek biedt verschillende voordelen ten opzichte van bestaande methoden zoals HPLC. Deze methode maakt de detectie van individuele glycoproteïnen in hun natuurlijke status mogelijk.

Het is sneller en eenvoudiger om glycosyleringswijzigingen voor meerdere eiwitten gelijktijdig te screenen. We hebben vastgesteld dat biomarkers voor ziekten, in het bijzonder voor kanker en leverkanker, waar we het meest nauwkeurig naar hebben gekeken, vaak glycosyleren. We hebben ontdekt dat het vermogen om specifieke glycovormen te detecteren de prestaties van biomarkers aanzienlijk verbetert in termen van sensitiviteit en specificiteit.

Deze meting kan dus inzicht bieden in glycosyleringsveranderingen van meerdere serumproteïnen bij HCC. Het kan ook worden toegepast bij pathologisch onderzoek en de ontdekking van biomarkers bij andere kankersoorten en ziekten, zoals pancreaskanker, diabetes en de ziekte van Alzheimer. De procedure zal worden gedemonstreerd door Chen Lu, een laborant uit mijn laboratorium.

Begin dit protocol met het voorbereiden van de antilichaam-microarray. Verdun eerst alle antilichamen die voor het printen van de microarray worden gebruikt tot een concentratie van 0,5 mg/mL in minimaal 40 mL PBS in 0,8 mL microcentrifugebuisjes op ijs. Hier worden 26 verschillende antilichamen als positieve controle gebruikt. Bereid daarnaast dezelfde hoeveelheid gebiotineerd BSA in PBS voor in een concentratie van 0,5 mg/mL. Gebruik een pipetteerhulpmiddel om 40 µL van elk antilichaam in de 384-well bronplaat op ijs over te brengen.

Wijs vervolgens in de software voor de microarray-besturing de locatie van elke antistof aan. Plaats daarna de plaat als bron op de microarray. Laad vervolgens 20 microarray-dia's van weefselpaden als doel op de microarray.

Stel de microarray zo in dat er 48 identieke sub-arrays worden geprint, waarbij 27 antilichamen en controle-eiwitten in triplikaat in een patroon van negen bij negen worden gespot. Start de microarray om de antibody microarray-slides te printen. Verzamel de antibody microarray-slides en bewaar deze in een slide-cassette met droogmiddel.

Sluit de cassette af in een plastic zak om denaturatie van eiwitten en vocht op de objectglaasjes tijdens de bewaring te voorkomen. Bewaar de afgesloten microarray-objectglaasjes bij vier graden Celsius tot aan het gebruik. Het meest kritische en lastige aspect van deze procedure is de chemische blokkeringsstap.

Om succes te garanderen, is het essentieel dat een voldoende hoeveelheid antilichamen op de microarray wordt geprint. Bereid altijd vers natrium-IDE en agro-zuurhydrocyte voor vlak voor het experiment. Zorg er bovendien voor dat de oxidatieprocedure wordt uitgevoerd bij 4 °C en onder afscherming van licht.

Haal de microarray-dia's uit de koelkast en laat ze 30 minuten acclimatiseren naar kamertemperatuur. Neem een dia uit de bewaarbox. Dompel de dia kort onder in een wasbak met PBS met 0,1% tween 20.

Dompel het objectglas vervolgens gedurende 10 minuten onder in 15 millimolar natriumacetaatbuffer met 0,1% tween. Bereid daarna verse 150 millimolar natriumperiodaat voor in 15 millimolar natriumacetaatbuffer en breng dit over naar een wasbak voor objectglazen. Bewaar dit in een koelkast, afgeschermd van licht, tot aan gebruik. Haal het objectglas uit de natriumacetaatbuffer en plaats het in de bak met vers natriumperiodaat, met de zijde met het antilichaam naar boven gericht.

Bedek het bad met aluminiumfolie om lichtinval te voorkomen. Plaats het objectglassenvat vervolgens bij vier graden Celsius gedurende twee uur met voorzichtig schudden. Neem het objectglas uit het bad en spoel het kort drie keer gedurende vijf minuten met natriumacetaatbuffer.

Incubeer de objectglasplaat gedurende twee uur bij kamertemperatuur met voorzichtig schudden in een incubatiekamer met 300 milliliter vers bereide 10 millimolaire hydroglutaminezuurbloqueringsoplossing. Verwijder de objectglazen uit de kamer en was deze gedurende drie minuten met PBS met 0,1% tween. Incubeer vervolgens de microarray-plaat in een wasbak voor objectglazen gedurende één uur bij kamertemperatuur met voorzichtig schudden in 300 milliliter 1% BSA in PBS met 0,5% tween.

Spoel de objectglazen drie keer gedurende drie minuten af in PBS met 0,1% tween. Plaats het objectglas in een objectglashouder en centrifugeer vervolgens 2 minuten bij 1.200 ×g om het microarray-objectglas te drogen. Om elke sub-array te scheiden, is er een wasraster op het objectglas gedrukt.

Nadat de wasafdrukker vijf minuten is voorverwarmd op 70 °C, wordt de geblokkeerde microarray-dia in de wasafdrukker geplaatst met de antilichaamzijde naar de was gericht. Trek voorzichtig aan de hendel om de was gelijkmatig op de dia af te drukken. Deze methode kan worden gebruikt voor het uitvoeren van glycoprofielanalyses van één enkel monster of voor het meten van één enkel glyco-epitoop in meerdere monsters.

Hier zullen we glycoprofileringsassays demonstreren. Begin met het verdunnen van 40 µL serum in 360 µL PBS dat 0,1% Tween 20, 0,1% bridge 35 en 100 µg/mL van elk van de muis, rat, konijn, geit en ezel IgG bevat. Dit volume is voldoende om zes µL van de verdunde serumoplossing op elke sub-array aan te brengen.

Breng voorzichtig zes µL van het verdunde monster of de controle aan op elke subarray van de slide. Incubeer de slide gedurende één uur bij kamertemperatuur in een bevochtigde cassette met natte papieren handdoeken. Spoel de slide drie keer gedurende drie minuten met PBS met 0,1% tween.

Droog het objectglas vervolgens door het twee minuten te centrifugeren bij 1200 ×g. Bereid 20 µL van de gebiotineerde glycaanbindende eiwitten met een concentratie van 10 mg/mL in PBS-tween voor in een microcentrifugebuis van 0,8 mL op ijs. Breng zes µL van de verdunde gebiotineerde lectinen aan op elke subarray van het objectglas en incubeer deze gedurende één uur bij kamertemperatuur in de bevochtigde objectglazenbox met natte papieren handdoeken.

Nadat de objectglaasjes drie keer zijn gespoeld met PBS met 0,1% tween zoals voorheen, wordt het objectglas gedroogd door het twee minuten lang in een centrifuge te centrifugeren bij 1200 ×g. Bereid in een 0,8 ml microcentrifugebuis op ijs 400 µL van 10 mg/mL DITE 5 49 gelabeld neut travain in PBS 0,1% tween voor. Gebruik een herhaalpipet om zes µL DITE 5 49 gelabeld neut travain op elke sub-array aan te brengen en incubeer het objectglas gedurende één uur bij kamertemperatuur in de bevochtigde cassette voor objectglaasjes na de incubatie.

Spoel de slide drie keer gedurende drie minuten met PBS 0,1% tween. Droog de slide door deze twee minuten te centrifugeren bij 1200 ×g. Scan de slide met een fluorescentie microarray-scanner bij een resolutie van 10 millimeter.

De laser- en PMT-instellingen moeten zo sterk mogelijk zijn, waarbij moet worden gegarandeerd dat er geen verzadiging optreedt. Open de afbeelding in array Pro 3.2. Stel het array-sjabloon in volgens de array-kaart die de locaties van de antilichaamspots aangeeft.

Lijn elke sjablooncirkel zorgvuldig uit op de overeenkomstige spot in de afbeelding en extraheer de intensiteit van elke spot naar een Excel-bestand voor verdere analyse. Een antibody microarray bestaande uit 48 identieke sub-arrays met 26 antilichamen tegen 20 serumglycoproteïnen en biotine-BSA is ontworpen en gefabriceerd zoals beschreven in deze video om het belang van de blokkeringsprocedure te onderzoeken.

Bij de analyse van glycoproteïneprofilering werden twee identieke microarray-dia's gegenereerd. Eén dia werd niet chemisch geblokkeerd, terwijl de andere dat wel werd; een controlemonster werd aangebracht op de sub-arrays in kolom één en drie, en een gepoold HCC-serummonster werd aangebracht op de sub-arrays in kolom twee en vier.

Biotinylslectinen die specifiek zijn voor verschillende glycanen werden vervolgens aangebracht op elke sub-array, zoals te zien is op deze afbeeldingen van de sub-arrays. Lectinen bonden aan de capture-antilichamen in de controlekolommen, wat resulteerde in een hoge achtergrond die niet te onderscheiden was van de kolommen waarin serum was geladen in de niet-geblokkeerde microarrays. Wanneer hetzelfde experiment echter werd uitgevoerd op een chemisch geblokkeerde antilichaam-microarray-dia, was er geen of zeer weinig binding aan de capture-antilichamen in de controlekolommen en een hoge antigeenbinding in de kolommen waarin serum was geladen.

Deze resultaten tonen aan dat de chemische blokkeringsprocedure een kritische stap is voor de meting van glycanen op door antilichamen gevangen glycoproteïnen. Door dit protocol te volgen, kunnen de glycosyleringsprofielen van 22 glycoproteïnen in HCC-serum worden verkregen. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in acht uur worden uitgevoerd mits correct uitgevoerd. Wanneer antilichamen worden gemodificeerd, kunnen zij hun affiniteit voor hun antigenen en andere eigenschappen verliezen.

Het is daarom belangrijk om hier rekening mee te houden en verschillende antilichamen uit diverse bronnen te gebruiken bij het volgen van deze procedure. Andere maatregelen, zoals het bepalen van de concentratie van elk eiwit met behulp van dezelfde microarray-dia, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of de verandering in glycosylering te wijten is aan een verandering in de eiwitexpressieniveaus of uitsluitend aan de glycosyleringsverandering van elk individueel eiwit. Vergeet niet dat het werken met serummonsters die pathogenen bevatten extreem gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden getroffen, zoals het dragen van beschermende handschoenen, tijdens het uitvoeren van deze procedure.