Toezicht op de reductieve en oxidatieve Half-reacties van een Flavin-afhankelijke mono-oxygenase met Gestopt-Flow Spectrofotometrie

Deze procedure maakt gebruik van een stopped-flowinstrument om de verschillende spectrale vormen van SID A te detecteren en reactiesnelheden te meten. De door SID A gekatalyseerde reactie kan worden onderverdeeld in reductieve en oxidatieve halfreacties van FAD. Het geoxideerde flavine bindt aan N-A-D-P-H en reageert tot gereduceerd flavine en NADP, waarna de reactie met moleculaire zuurstof en de binding van ornithine resulteren in de vorming van C vier.

Een hydroxyflavine; na hydroxylering van ornithine dehydrateert het hydroxyflavine om het geoxideerde enzym te vormen. NA DP plus blijft gedurende de gehele katalytische cyclus gebonden en is het laatste substraat dat wordt vrijgegeven. Het stopped-flow instrument faciliteert het snel mengen van kleine volumes reactanten en registreert.

Met een spectrophotometer kunnen de spectrale veranderingen in de loop van de tijd worden gemeten, wat het mogelijk maakt om de vormingssnelheid en het verlies van een enzymgecatalyseerde reactie te bepalen, specifiek voor transiënte intermediairen. Twee leden van mijn laboratorium, Rita Robinson en Enviro Romero, zullen deze experimenten demonstreren met behulp van set A, waarbij flavor mono-oxygenase als modelsysteem dient. Giet 250 milliliter 100 millimolaire kaliumfosfaatbuffer in een Büchnerkolf van 500 milliliter waarin een roerstaf zich bevindt.

Sluit de kolf af met een rubberen stop, plaats deze vervolgens op een roerplaat en verbind de korte tuit van de kolf met een schlenklijn. Ontgas de buffer onder vacuüm gedurende een uur bij kamertemperatuur onder agitatie, gevolgd door spoelen met argon. Herhaal dit vijf keer.

Spoel de kolf tot slot 10 seconden lang door met argon. Koppel de kolf los van het vacuümm manifold en plaats deze in de glovebox. Ga door met krachtig roeren terwijl de kolf open blijft.

Vul de reservoir-spuiten met glucose-oxidase-oplossingen van 18,13 units per milliliter en glucose-oplossingen van 100 millimolair. Zet nu de aandrijfventielen in de laadpositie. Vul de aandrijfspuiten.

Draai vervolgens de F-klep naar de aandrijfpositie. Klik in de pro data-besturingssoftware op 'stopspuit legen' en pers vervolgens de buffer uit aandrijfspuit F door het stroomcircuit door de bijbehorende aandrijfschuif handmatig omhoog te bewegen. Herhaal dit voor de overige drie aandrijfspuiten en laat het systeem een uur equilibreren.

Vul nu de reservoir-spuiten opnieuw en herhaal het spoelen van het gestopte flowsysteem. Om zuurstofverzadigde buffer te bereiden, wordt de oplossing gedurende één uur onder agitatie gebubbeld met 100% oxygen.

Verwijder vervolgens de korte naald uit het vial en wacht 10 seconden. Verwijder daarna de lange naald en plaats het gesloten vial in de glovebox. Doe hetzelfde voor de N-A-D-P-H oplossing.

Plaats een eppendorfbuisje van 1,5 milliliter met één milligram NADPH in de glovebox. Los dit op in 300 microliters anaerobe, 100 millimolaire kaliumfosfaatbuffer, pH 7,5.

Verwijder 30 µL om de NADPH-concentratie te bepalen. Om nu zuurstof uit de enzymvoorraad te verwijderen, wordt de oplossing overgebracht naar een flacon van 25 mL met een roerstaaf, dop en aluminium zegel.

Sluit het aan op een Schlenk-lijn, ontgas vervolgens gedurende 20 minuten via vacuüm, gevolgd door spoelen met argon. Spoel het vial tot slot 10 seconden met argon en koppel het los van het vacuümmannifold. Plaats het vial op ijs in de glovebox.

Selecteer in het venster van het controlepaneel van de pro data control-software de fotodiodearray, de externe trigger en de logaritmische schaal. Start daarnaast de pro data viewer-software op en definieer de directory voor de opslag van de gegevensbestanden.

Vervang nu de oplossing in de reservoir-spuiten C en F door anaerobe 100 millimolaire kaliumfosfaatbuffer pH 7.5. Draai de kleppen C en F naar de aandrijfpositie. Klik in de pro data-besturingssoftware op het legen van de stop-spuit.

Duw vervolgens de buffer vanuit beide aandrijtspuiten door het stroomcircuit door de overeenkomstige aandrijstempel handmatig omhoog te bewegen. Herhaal het spoelen met reservoirpsuiten C en F nog drie keer. Om de volledige verwijdering van glucose-oxidase uit het stroomcircuit te waarborgen, klikt u vervolgens op baseline in de pro data control-software.

Vervang de oplossing in de reservoirspuit F door de enzymoplossing. Draai de F-kraan naar de aandrijfpositie. Klik in de pro data control-software op 'empty the stop syringe'.

Duw de enzymoplossing vanuit aandrijfspuit F door het stroomcircuit door de bijbehorende aandrijfschuif handmatig omhoog te bewegen. Keer terug naar de pro data-besturingssoftware om de acquisitietijd op 60 seconden in te stellen. Controleer of beide aandrijfspuiten zijn gevuld met de overeenkomstige oplossingen en of de aandrijfschuiven in contact staan met de zuigers van de aandrijfspuiten.

Zet beide kleppen in de aandrijfpositie en klik op 'acquire' in de Pro Data Control-software om de aandrijving uit te voeren. Verzamel in triplo spectrale gegevens van de geoxideerde vorm van het enzym met gebruik van de A 452 nanometer-waarde verkregen uit de aandrijvingen. Bepaal de enzymconcentratie vóór het mengen en bereid vier milliliter NADPH-oplossing.

Vul reservoirspuit C met een 1,5 keer meer geconcentreerde N-A-D-P-H oplossing en leeg en vul de stopspuit drie keer opnieuw, zoals eerder gedemonstreerd. Neem nu spectra op tijdens de reductie van het enzym en spoel de inhoud uit het stroomcircuit met anaerobe 100 millimolar kaliumfosfaatbuffer pH 7,5. Klik nu op baseline in de pro data-besturingssoftware.

Meng vervolgens 200 µL van de enzymvoorraadoplossing met 1000 µL anaerobe, 100 mM kaliumfosfaatbuffer, pH 7.5. Vervang de vloeistof in reservoirspuit A door de enzymoplossing.

Zet klep A in de software voor pro data-besturing op de stand 'drive'. Klik op 'stop syringe empty'. Duw de enzymoplossing uit drive-spuit A door het stroomcircuit door de bijbehorende drive-ram handmatig omhoog te bewegen.

Stel de vertragingstijd in op 0,5 seconden en de acquisitietijd op 60 seconden. Controleer of alle aandrijfspuiten zijn gevuld met de bijbehorende oplossingen en of de aandrijfzuigers in contact staan met de zuigerkoppen van de aandrijfspuiten. Zet vervolgens alle aandrijfventielen in de aandrijfpositie en klik op 'acquire' in de pro data control-software.

Verkrijg in drievoud de spectrale gegevens van de geoxideerde vorm van het enzym. Vervang vervolgens de oplossing van reservoirspuit B door een N-A-D-P-H-oplossing die 1,5 maal geconcentreerder is dan de enzymoplossing in spuit A. Zet klep B in de aandrijfpositie en maak de stopspuit drie keer leeg en vul deze opnieuw, zoals eerder wordt getoond in het venster van het bedieningspaneel.

Stel de vertragingstijd in op 0,5 seconden. Voer bij een acquisitie van 20 seconden de oplossing van de reservoirspuit sea vervangen door de zuurstofrijke buffer. Zet de C-klep in de aandrijfpositie.

Spoel drie keer door in de pro data control-software. Stel de vertragingstijd in op 15 seconden en de acquisitietijd op 900 seconden. Ga door met het verwerven van spectra tijdens de re-oxidatie van het volledig gereduceerde enzym in het stopped flow-instrument.

De anaerobe reductie van SID A met N-A-D-P-H kan worden gemonitord door veranderingen in de redoxstatus van het flavine te meten met absorptie bij 452 nm. Spectrale veranderingen worden in de tijd vastgelegd, van geoxideerd SID A tot het laatste spectrum van volledig gereduceerd SID A. De snelheid van deze enzymatische stap kan worden bepaald door de gegevens te fitten aan de juiste vergelijking. De oxidatiesnelheid en de reactie-intermediaten kunnen ook worden bepaald met behulp van de double mixing-modus van de stopped flow in deze reactie door AF Sid A. Het C4A hydroxyflavine-intermediaat wordt duidelijk gedetecteerd met een lambda max van 380 nanometer en het geoxideerde enzym heeft een lambda max van 450 nanometer.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in vier tot zes uur worden voltooid indien correct uitgevoerd. Denk eraan om te controleren of de oplossingen anaerobe zijn. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe zowel de relatieve als de ulceratieve ionen van FLA-onafhankelijke mono kunnen worden onderzocht in verdere downstream experimenten, zoals snelle chemie.

Quentin kan helpen om de aard van de intermediairen te verduidelijken.