Lokale en globale methoden voor de beoordeling Thermische Nociceptie in

Het algemene doel van het volgende experiment is om de thermische nociceptie bij drosophila-larven te analyseren. Dit wordt bereikt door drosophila-larven te oogsten om ze vervolgens bloot te stellen aan schadelijke thermische stimuli; als optionele tweede stap kunnen de larven worden bestraald met UV-licht, wat weefselschade en thermische nociceptieve sensibilisatie veroorzaakt. Vervolgens kunnen de larven lokaal worden geprikkeld met een hitteprobe of globaal met een warmteplaat om nociceptieve reacties op te wekken die kwantitatief gemeten kunnen worden.

De hitteprobe laat zien dat larven een bovengrens hebben aan de nociceptieve respons op hitte, en dat er een verrassende relatie bestaat tussen de inputtemperatuur en de amplitude van de opgewekte respons. De hitteplaat-assay laat zien dat larven een stereotype sequentie van nociceptief gedrag vertonen die afhankelijk is van de temperatuur van het omringende water en de activiteit van de nociceptieve sensorische neuronen. De hier beschreven methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de thermische nociceptie, zoals de vraag of dieren verschillend reageren op schadelijke thermische stimuli die respectievelijk lokaal of globaal worden gepresenteerd.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met de heat probe assay moeite hebben, omdat het beheersen van de assay oefening vereist om variatie in de druk, de locatie en de hoek van de aangebrachte probe te minimaliseren. Een visuele demonstratie van de heat plate assay is cruciaal, aangezien de gedragingen die worden opgewekt bij stijgende temperatuur het best begrepen kunnen worden door ze te zien. Om voldoende nakomelingenlarven van een gedefinieerd genotype van belang te verkrijgen, kweekt u de gewenste stam direct of stelt u kruisingen op in flessen met vliegenvoedsel met gebruik van 20 tot 30 maagdelijke vrouwtjes en 15 tot 20 mannetjes; oogst vijf dagen na de eiafzetting en reinig vroege derde-instar larven door het zachte vliegenvoedsel eruit te scheppen en te zeven met zacht stromend water door een gaas met een poriegrootte van 630 micron; breng de vroege derde-instar larven over naar een klein, vochtig bedje voedsel om uithongering en uitdroging te voorkomen.

Nadat een anesthesiekamer is geconstrueerd, wordt met een pincet of een penseel voorzichtig 10 larven in het vroege derde stadium langs de binnenkant van het deksel geplaatst en wordt dit gesloten. In een zuurkast wordt de anesthesiekamer in een koppelpot geplaatst die een bekerglas van 10 milliliter bevat met een wattenstaafje gedrenkt in 1,5 milliliter diethylether. Draai de dop van de koppelpot vast om de larven gedurende twee tot 2,5 minuten bloot te stellen aan etherdampen.

Verwijder na de anesthesie de anesthesiekamer uit de Coplan-pot en wacht enkele seconden in de zuurkast zodat eventuele resterende etherdampen kunnen verdwijnen. Gebruik een spuitfles met water om de larven voorzichtig uit de anesthesiekamer in een kleine Petrischaal te spoelen. Dep de geanestheseerde larven droog en bevestig ze vervolgens voorzichtig met de rugzijde naar boven op een strook dubbelzijdige plakband die is bevestigd op een glazen microscoopglaasje van drie bij één inch.

Plaats het objectglas op het onderste oppervlak van een UV-bestralingskamer en stel de larven zes seconden lang bloot aan UV-licht met een intensiteit van 20 millijoules per centimeter squared. Dompel het objectglas na bestraling onder in water om de larven voorzichtig van de dubbelzijdige plakband te laten drijven. Gebruik een pincet of een schilderspenseel om de bestraalde larven voorzichtig in een 15 by 45 millimeter te plaatsen.

Eén glazen kweekbuisje van één dram met één milliliter vliegenvoedsel om de larven acht tot 24 uur te laten herstellen bij 25 °C of de gewenste kweektemperatuur voordat ze opnieuw worden gehuisvest. Stel voor thermische nociceptie-assays eerst de temperatuur van de thermische probe in op het gewenste referentiepunt. Gebruik een penseel of een pincet om een individuele larve voorzichtig over te brengen naar een plat platform, waarbij moet worden gewaarborgd dat de larve bedekt is met een dunne waterfilm.

Om variaties in druk te minimaliseren en de juiste locatie en hoek van de hitteprobe te waarborgen, is oefening essentieel. Druk de punt van de probe voorzichtig tegen de larven aan bij segment A4, waarbij lichte druk wordt uitgeoefend met de punt in een hoek van ongeveer 45 graden tussen de probe en het oppervlak van de larven. De druk moet een lichte inkeping op het oppervlak van de larven veroorzaken en is doorgaans voldoende om locomotie te voorkomen.

Stimuleer de larven verder totdat er een terugtrekrespons optreedt of totdat de 22e cutoff is bereikt. Reagerende larven vertonen doorgaans eerst een preliminair gedrag waarbij de kop en staart worden opgetild, gevolgd door het terugtrekgedrag van minstens 360 graden rollen. Zodra het terugtrekgedrag is ingezet, verbreek dan het contact met de probe en noteer de latentie of de tijd die nodig is voor de terugtrekking.

Indien er binnen 20 seconden geen terugtrekgedrag wordt waargenomen, wordt de larve beschouwd als een non-responder. Positioneer de glasvezellichtgeleiders om te garanderen dat er sprake is van adequate hoogcontrastverlichting. Om de larven te kunnen bekijken, plaatst u het verwarmingsblok met de vlakke zijde naar boven in de warmteplaat en plaatst u vervolgens de warmteplaat op de microscoopvoet.

Zet de warmteplaat op de hoge stand en wacht ongeveer 15 minuten tot de temperatuur is gestabiliseerd op 95 °C. Meet 80 µL gedestilleerd water en plaats de waterdruppel met een micropipet in het midden van een polystyreen Petri-schaal van 60 bij 15 mm. Gebruik een pincet om voorzichtig een schone larve in het midden van het derde instar-stadium in de waterdruppel te plaatsen, waarbij zo min mogelijk extra water wordt geïntroduceerd.

Plaats de Petrischaal voorzichtig op het vaste verwarmingsblok op de warmteplaat. Pas snel de positie van de schaal aan, zodat de volledige larve en de waterdruppel in beeld zijn. Start de timer.

Op dit moment wordt de Petrischaal op het vaste verwarmingsblok van de warmteplaat geplaatst en wordt het tijdstip van het begin van elk gedrag genoteerd. Vijf. Stereotype locomotieve gedragingen worden waargenomen wanneer de larve, ondergedompeld in water, naar de warmteplaat wordt overgebracht. Normaal gedrag in afwezigheid van hitte omvat parasol-locomotie, vergezeld van zoekende hoofdbewegingen.

Vervolgens kan het 'head thrash'-gedrag optreden, waarbij de larve haar kop snel in een voorwaartse of zijwaartse beweging beweegt. Deze beweging lijkt op hun normale voortbeweging in water, maar vindt schokkeriger en met aanhoudend rollen plaats. Het gedrag treedt op wanneer de larven zijdelings ten minste een volledige 360 graden rollen.

Dit kan een variabel aantal keren voorkomen en omvat soms onvolledige rollen. Tel voor de score van het gedrag alleen volledige rollen van 360 graden. Dit gedrag vertoont de meeste gelijkenis met de scène waarin de hitteprobe lokaal wordt toegepast tijdens het zweepgedrag.

De larve vertoont snelle samentrekkings- en ontspanningsbewegingen langs de anterieur-posterieure as, waardoor de kop heel kortstondig dicht bij de staart komt. Zwepende bewegingen worden vaak in snelle opeenvolging of gelijktijdig met rollen waargenomen. Tot slot vertoont de larve epileptisch-achtig gedrag, vaak gevolgd door verlamming. Tijdens dit gedrag strekt de larve zich uit langs de anterieur-posterieure as en vertoont deze een hoogfrequente trilling van het hele lichaam.

Schudgedrag zonder buigingsverlamming treedt op wanneer de larven stoppen met bewegen. Bij sommige larven is dit permanent, terwijl anderen vervolgens een laagfrequente pulserende beweging vertonen. In deze grafiek van het percentage responders per categorie is er een plafond voor de thermische nociceptieve respons van de larven. In de heat probe assay zijn 100% van de larven snelle responders tot een probe-temperatuur van 52 °C.

Echter, bij 54 °C en hoger reageert 90% of meer van de larven niet, zelfs niet na 20 seconden contact. Hoewel deze larven na de 22e afsnijwaarde blijven bewegen, kunnen het aantal rollen of de tijd besteed aan aversie-terugtrekgedrag ook worden gemeten en uitgezet. Verrassend genoeg lijkt er een omgekeerd verband te bestaan tussen de temperatuur van de probe en de robuustheid van de respons, aangezien lagere temperaturen een hoger aantal rollen lijken op te wekken.

Bij overdracht van de in water ondergedompelde larve naar de warmteplaat worden vijf stereotiepe locomotieve gedragingen waargenomen. De gemiddelde latentietijden waarin deze gedragingen worden waargenomen, worden hier getoond, evenals de gemiddelde temperaturen van de waterdruppel gemeten voor elke latentie onder de hier gepresenteerde optimale assay-condities; het percentage larven dat elk afzonderlijk gedrag vertoonde varieerde van 77 tot 100%, hoewel het rollende en zwiepende gedrag af en toe werden overgeslagen, overlapten of in omgekeerde volgorde voorkwamen. Het percentage larven dat overleefde na de aanvang van het verlammingsgedrag in de warmteplaat-assay wordt hier getoond. Larven werden verhit tot verlamming en vervolgens overgeplaatst naar standaard kweekcondities om te herstellen.

De schijnbehandelde larven kregen een gelijkwaardige behandeling, behalve de blootstelling aan hitte, en de vorming van PPE in levensvatbare volwassenen werd kwantitatief bepaald op dag zeven tot 13. Hier stimuleert MD G four de expressie van UAS-gereguleerde transgenen in alle vier de klassen van multidendritische perifere sensorische neuronen. UAS or one delta C tot expressie brengt een gemodificeerde versie van het drosophila open-rectifier kaliumkanaal dat vereist is voor synaptische transmissie, en UAS orrc one delta NC tot expressie brengt een verder gemodificeerde versie van hetzelfde kanaal die de synaptische transmissie niet verstoort.

Let op dat alleen larven die zowel de MD GALF four driver als het UAS ORC one delta C transgen dragen, verhoogde latentietijden vertonen voor vier van de vijf waargenomen gedragingen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe zowel lokale als globale responsen van GEs offal larven op schadelijke thermische stimuli kunnen worden gemeten. Deze procedures kunnen worden gecombineerd met andere methoden, zoals genetische analyse, om de genen te identificeren die vereist zijn voor thermische nociceptie. Bij het uitvoeren van de heat probe assay is het belangrijk om variatie in druk, locatie en contacthoek van de probe te minimaliseren.