Omzetting van een Capture ELISA aan een Luminex xMAP test met behulp van een Multiplex Antilichaam screeningsmethode

Het algemene doel van het volgende experiment is om een vooraf geoptimaliseerde ELISA-assay voor het cytokine TNF Alpha over te zetten naar het Xap-platform, terwijl alternatieve antilichaamparen worden geëvalueerd. Dit wordt bereikt door het capture-antilichaam uit de ELISA-kit, samen met drie andere kandidaat-capture-antilichamen, te koppelen aan vier verschillende microsfeer- of bead-sets wanneer deze worden gemengd. Deze vier sets maken het mogelijk om alle vier de kandidaten gelijktijdig te testen met vier aparte detectie-antilichamen om het beste antilichaampaar te bepalen.

Vervolgens worden twee Xap-assays opgebouwd met de twee meest optimale antilichaamparen. De prestaties van de assays worden daarna vergeleken met die van de oorspronkelijke EISA-assay met betrekking tot signaalsterkte, dynamisch bereik en gevoeligheid. De resultaten tonen aan dat vergelijkbare antilichamen onder dezelfde omstandigheden zeer verschillend kunnen presteren en dat meerdere antilichamen gelijktijdig gescreend kunnen worden met de Luminex Xap-assay, waaruit blijkt dat deze assay een verhoogde gevoeligheid en een groter dynamisch bereik heeft in vergelijking met EISA.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals EIS A is dat xap-gebaseerde immunoassays de onderzoeker in staat stellen om meerdere doelen te testen, of in dit geval, meerdere antilichamen gelijktijdig te testen. Om het beste aangetoonde antilichaam te identificeren, zal de procedure worden uitgevoerd door Erica Lopez, associate scientist bij Luminex Corporation.

Begin dit protocol met de selectie en preparatie van vier capture-antilichamen en vier detectie-antilichamen specifiek voor humaan TNF alpha, zoals beschreven in het geschreven protocol. Bereid daarnaast één bevestigingsantilichaam voor dat specifiek is voor de gastsoort van de capture-antilichamen. Breng de reagentia van de antibody coupling kit naar kamertemperatuur.

Label vier reactiebuisjes met de beadregionummers die zijn geselecteerd voor de koppelingsreactie. Draag de inhoud van de vier flesjes mag plex microsferen over naar de vier gelabelde reactiebuisjes. Was elke set beads twee keer in 500 µL activatiebuffer en activeer elke set beads met de sulf ONHS- en EDC-oplossingen zoals beschreven in de antibody coupling kit.

Gebruikershandleiding: na een incubatie van 20 minuten op een rotator wordt de vorige wasstap met de nu geactiveerde beads in totaal drie keer herhaald met 500 µL activatiebuffer. Bereid voor elke wasbeurt vier aparte oplossingen van 500 µL voor, elk bevatten deze 7,5 µg capture-antilichaam inactivatiebuffer.

Voeg deze vier capture-antilichaamoplossingen toe aan de respectievelijke reactiebuisjes. Vortex elk buisje onmiddellijk en incubeer gedurende twee uur op een rotator. Herhaal de wasstap met de nu gekoppelde beads in totaal drie keer met 500 µL van de wasbuffer die bij de antilichaam-koppelingskit is geleverd.

Voeg na de laatste wasstap 500 µL wasbuffer toe aan elke reactiebuis om een uiteindelijke voorraadconcentratie van 5 miljoen antilichaam-gekoppelde beads per mL te verkrijgen, vortex, en soniceer vervolgens de reactiebuizen om de beads te dispergeren. Tel het aantal beads dat na de koppelingsreactie is teruggewonnen met behulp van een celteller of hemocytometer. Het rendement van de koppelingsreactie is doorgaans hoger dan 90%. Bevestig dat de koppelingsreactie succesvol was door voor elke set testoplossingen van de gekoppelde bead-voorraden te bereiden met een uiteindelijke concentratie van 100 beads per µL in assaybuffer, en bereid verdunningen voor van de FICO erything gelabelde antis species.

Verdun het IgG-bevestigingsantilichaam tot 4 µg/mL in assaybuffer. Pipetteer 50 µL van elke testoplossing in vier wells van een 96-wellplaat met ronde bodem, voor een totaal van 16 wells. Voeg vervolgens 50 µL assaybuffer toe aan acht van de wells om de achtergrond te meten en 50 µL van het verdunde bevestigingsantilichaam aan de overige acht wells. Meng de reacties voorzichtig door meerdere keren op en neer te pipetteren met een multichannelpipet.

Dek de plaat af en incubeer deze 30 minuten bij kamertemperatuur op een plaatshaker. Plaats de plaat één tot twee minuten op een magnetische plaatseparator om de beads uit de oplossing te trekken. Verwijder vervolgens de vloeistof door de plaat, terwijl deze op de separator staat, krachtig om te keren boven een afvalbak.

Was elke well twee keer door 100 µL assaybuffer toe te voegen en de SANE op vergelijkbare wijze van de plaat te verwijderen. Resuspendeer de beads met behulp van de magnetische plaatseparator in 100 µL assaybuffer door vijf keer voorzichtig op en neer te pipetteren met een multichannel-pipet. Analyseer op een Luminex xMAP-instrument, zoals het Magix-instrument.

De intensiteit van het fluorescentiesignaal van deze reactie is recht evenredig met de hoeveelheid eiwit op het oppervlak van de beads, wat een snelle beoordeling mogelijk maakt van de relatieve hoeveelheid eiwit die aan de beads is gekoppeld. Om het meest effectieve antilichaampaar in de xap-assay te bepalen, wordt een initiële mengeling van alle vier de bead-sets bereid door 10 µL van elk toe te voegen aan 0,96 mL assaybuffer. Bereid de detectie-antilichaamoplossingen door elk antilichaam te verdunnen tot 1 µg/mL in assaybuffer.

Tevens een assaybuffer. Bereid de r and d systems TNF alpha proteïnestandaard in een concentratie van 2000 picograms per milliliter en verdun de Streptavidin R FICO eryn tot acht micrograms per milliliter. Voeg 50 microliters van het mengsel van antilichaam-gekoppelde beads toe aan elk van de 16 wells van een CoStar round bottom 96 well plaat voor de screening assay.

Voeg vervolgens 50 µL assaybuffer toe aan acht van de 16 wells om de achtergrond te meten. Pipetteer daarna 50 µL van de TNF alpha-standaard in de overige acht wells om de respons te meten. Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht, terwijl de plaat wordt geschud op een assayplaat-shaker.

Voeg vervolgens 50 µL van elk van de vier detectieantilichamen toe aan vier wells, waarvan twee achtergrondwells en twee respons-wells zijn. Incubeer gedurende 30 minuten onder dezelfde omstandigheden, gevolgd door de toevoeging van 50 µL SAPE-reagens aan alle wells. Incubeer opnieuw gedurende 15 minuten onder dezelfde omstandigheden.

Plaats de plaat gedurende één minuut op een magnetische plaatseparator. Verwijder vervolgens de vloeistof door de plaat, terwijl deze op de separator staat, krachtig om te keren boven een afvalbak. Pipetteer 100 µL assaybuffer in elk van de 16 wells.

Verwijder vervolgens de vloeistof van de beads met behulp van magnetische scheiding. Voeg daarna 100 µL assaybuffer toe aan elk van de 16 wells. Lees de plaat af met het Luminex mag picks instrument, waarbij u voor de juiste bediening de gebruikershandleiding raadpleegt.

Selecteer een antilichaampaar dat voldoet aan de gewenste signaalsterkte. Nadat het beste capture-antilichaam is gekozen, wordt 100 µL van de stockoplossing van de gekoppelde beads van dat antilichaam verdund tot 10 mL met assaybuffer. Voeg 50 µL van de verdunde beads toe aan 78 wells van twee CoStar ronde bodem 96-well platen.

Elke plaat wordt gebruikt om de prestaties van een ander detectie-antilichaam te beoordelen. Bereid vervolgens een standaardcurve van 12 punten voor, beginnend bij 8,000 picograms per milliliter en eindigend bij vier picograms per milliliter. Met de r and d systems.

Voeg voor de TNF Alpha-standaard zes replica's van 50 µL van elke verdunning toe aan elk van de platen, plus zes wells met elk 50 µL assaybuffer als achtergrond, voor een totaal van 78 wells per plaat. Incubeer de platen gedurende één uur bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht, terwijl ze worden geschud op een assayplaat-shaker. Voeg vervolgens 50 µL van het eerste detectie-antilichaam toe aan alle 78 wells van de eerste plaat.

Herhaal dit voor het tweede detectie-antilichaam op de tweede plaat. Incubeer de platen gedurende 30 minuten onder dezelfde omstandigheden. Voeg vervolgens 50 µL van het SAPE-reagens toe aan alle wells van elke plaat.

Nadat de twee platen 15 minuten lang lichtbeschermd zijn geschud, worden de platen gedurende één minuut op magnetische plaatseparators geplaatst. Verwijder de vloeistof door de plaat, terwijl deze op de separator staat, krachtig om te keren boven een afvalbak. Pipetteer vervolgens 100 µL assaybuffer in elk van de 78 wells op de platen, nadat de vloeistof van de magnetische beads is verwijderd.

Voeg honderd µL assaybuffer toe aan de beads in elk van de 78 wells op de platen en analyseer de platen vervolgens op het MagPicks-instrument, waarbij u voor de juiste bediening het gebruikershandboek raadpleegt. Volg de instructies die zijn meegeleverd met de R&D Systems Human TNF Alpha TNF SF1a DuoSet ELISA-kit. Meet de respons die wordt gegenereerd door de standaard die bij de R&D-kit is geleverd.

Herhaal de ELISA-analyse nog drie keer, waarbij de capture- en detectie-antilichamen van R&D Systems worden vervangen door de antilichamen van de andere leveranciers. Koppel voor de eenvoud de antilichamen per leverancier en evalueer elk paar onafhankelijk, zoals vereist door het EISA-formaat, met elk van de drie TNF Alpha-proteïnestandaarden. Luminex Xap-assays werden uitgevoerd als een multiplex om alle vier de capture-antilichamen als mengsel te evalueren door vier sets van TNF alpha-antilichamen gekoppeld aan Mag PLX-microsferen te combineren; de capture-antilichamen werden individueel geëvalueerd met elk van de vier gebiotineerde detectie-antilichamen, zodat de interactie van één detectie-antilichaam met elk van de vier capture-antilichamen gelijktijdig kon worden bepaald.

De resultaten gaven aan dat het antilichaampaar uit de r and d systems DUO-set het beste presteerde, met een resulterende respons van 6.183 mediane fluorescentie-intensiteit of MFI-eenheden. Er werd ook waargenomen dat de detectieantilichamen van Millipore en ABAM een redelijke respons gaven in de XAP-assay wanneer deze werden gecombineerd met het capture-antilichaam van RD systems; de capture-antilichamen van Millipore, ACAM en Novus produceerden een minder wenselijke respons in de XAP-assay. Het protocol van de r and d systems DUO-set werd gebruikt om de vier antilichaamparen in een EISA-formaat te vergelijken.

Het protocol van R&D Systems werd gebruikt voor alle antilichaamparen, omdat dit een weerspiegeling is van de typische EIA-protocollen die tegenwoordig veelvuldig worden toegepast en omdat het analoog is aan de protocollen die bij XAP-technologie worden gebruikt. De EISA-tests toonden aan dat het antilichaampaar van R&D Systems opnieuw de beste resultaten gaf. Het antilichaampaar van Acam produceerde geen respons, en de antilichaamparen van Millipore en Novas produceerden bescheiden responsen om eventuele variatie in antilichaamreactiviteit te beoordelen.

Met de standaard werden alle vier de antilichaamparen getest met drie verschillende recombinante TNF alpha proteïnestandaarden van drie verschillende leveranciers. De gegevens tonen aan dat de recombinante TNF alpha proteïnestandaarden van de drie leveranciers gelijkwaardige resultaten gaven. Het TNF alpha proteïne van r and d systems werd gebruikt om standaardcurven te genereren met de ELSA- en de XAP-assays.

Hoewel de ELI A-assay werd uitgevoerd met het antilichaampaar van R&D Systems, maakten de Xap-assays gebruik van het capture-antilichaam van R&D Systems en het detectie-antilichaam van ofwel R&D Systems of Millipore. Het TNF-alpha-eiwit van R&D Systems werd verdund om een concentratiebereik van 8.000 tot 4 pg/mL te verkrijgen. Het antilichaampaar van R&D Systems leverde het verwachte resultaat op in de Xap-assay, met een respons groter dan 20.000 MFI zoals weergegeven.

Wanneer het detectie-antilichaam van Millipore werd gebruikt in de Xap-assay in plaats van het detectie-antilichaam van R&D Systems, was de respons ongeveer 30% van de respons die werd verkregen met het detectie-antilichaam van R&D Systems. De groene lijn in deze grafiek vertegenwoordigt de standaardcurve van de ELISA, die een door de fabrikant aanbevolen TNF-alpha-bereik had van 16 tot 1000 picograms per milliliter. Vanwege de limiet van de spectrofotometer was het niet mogelijk om het bereik van de ELISA-assay te vergroten.

Verder worden het dynamische bereik en de gevoeligheid van beide methoden beter geïllustreerd wanneer deze op een logaritmische schaal worden uitgezet. Er is een duidelijk onderscheid zichtbaar tussen de helling van de EISA-respons en de responsen van de xap-assays, wat verder wijst op een meer beperkt detectievermogen voor TNF alpha met de ELISA bij zowel hogere als lagere concentraties. De detectielimieten of LOD voor de twee functionele TNF alpha xap-assays werden benaderd door de laagste TNF alpha-concentratie te identificeren met een waargenomen responsniveau dat hoger was dan de achtergrond, plus drie keer de standaarddeviatie of SD van zes herhalingen.

Hier kan worden waargenomen dat bij gebruik van het paar van r and d systems de laagste TNF alpha concentratie van 3,91 picograms per milliliter een respons van 66 MFI produceerde, wat groter is dan de respons voor de achtergrond plus drie SD, waarmee aan dit criterium wordt voldaan. Wanneer het Millipore detectie-antilichaam werd gebruikt samen met het r and d systems capture-antilichaam, was de detectielimiet minder dan 7,81 picograms per milliliter.

In dit geval was de op één na laagste TNF alpha-concentratie die een acceptabele respons produceerde met 17 MFI hoger dan de respons van de laagste TNF alpha-concentratie plus drie keer de standaarddeviatie daarvan. Evenzo werd de detectielimiet voor de r and d systems duo set Eliza geschat op tussen 63 en 31 picogram per milliliter. Na deze procedure kunnen andere stappen, zoals het testen van diverse monstermatrices of antilichaamconcentraties in de reporter, worden uitgevoerd om de xap-assay verder te optimaliseren.