High-throughput screening voor kleine-molecule Modulators van Actieve Rectifier kaliumkanalen

Het algemene doel van deze procedure is het ontdekken van nieuwe verbindingen die de activiteit van inward-rectifier kaliumkanalen moduleren. Dit wordt bereikt door eerst tetracycline-induceerbare HK 2 9 3-cellen, die een KIR-kanaal van belang tot expressie brengen, uit te platen in een 384-wellplaat. De tweede stap bestaat uit het laden van de cellen met een fluorescente thallium-reporterkleurstof genaamd flu in two.

Vervolgens wordt de niet-geïncorporeerde kleurstof uit de cellen gewassen en vervangen door assaybuffer die een vehikelcontrole of testverbindingen bevat. De laatste stap is de toevoeging van een stimulusbuffer aan de putjes om de thalliumflux te initiëren. Ten slotte wordt een fluorescentieplaatlezer gebruikt om de verbindingen te identificeren die de beweging van thalliumionen door het KIR-kanaal veranderen.Slecht.

Het belangrijkste voordeel van deze methode ten opzichte van bestaande technieken, zoals handmatige patchclamp-elektrofysiologie, is dat het de onderzoeker in staat stelt om honderden experimenten gelijktijdig en duizenden experimenten per dag uit te voeren. Deze methode stelt de onderzoeker in staat om bibliotheken van duizenden kleine moleculen te screenen om modulatoren van inwaarts gelijkrichtende kaliumkanalen te ontdekken. Dissocieer een dag voor het thalliumflux-experiment de cellen en kwantificeer de dichtheid van de celsuspensie zoals beschreven in het bijbehorende manuscript. Gebruik vervolgens het BH-medium dat 10% gedialyseerd FBS bevat en plateer 20 000 monoklonale cellen, stabiel getransfecteerd met een KIR-kanaalgen van belang, in elke put van een BD pure coat Amin-gecoate 384-well plaat met behulp van een thermo multi drop combi of een multikanalenpipetteur. Inspecteer de volgende dag de plaat onder een microscoop om te controleren of de cellen adherent zijn en gelijkmatig over de bodem van de putten zijn verdeeld.

Gebruik vervolgens een ELX 4 0 5 microplate washer om het celkweekmedium te vervangen door HBSS assaybuffer tegen 20 µL per putje. Bereid daarna de flus in 2:00 AM D laadoplossing voor door de buis kortstondig te centrifugeren om 50 µg flus in twee poeder op te lossen in 100 µL watervrij DMSO.

Voeg nu 50 µL van een 20% gewicht per volume onic F1 27 DMSO-oplossing toe aan de kleurstof. Meng deze door voorzichtig te pipetteren. Voeg vervolgens 150 µL van flus in 2:00 AM onic F1 27 toe aan 35 mL HBSS assaybuffer en meng voorzichtig.

Voeg vervolgens 20 µL kleurladingsbuffer toe aan elke put die al 20 µL HBSS assay.Buffer bevat. Incubeer de cellen gedurende ongeveer één uur bij kamertemperatuur, terwijl de cellen worden geladen met de kleurstof. Bereid een thalliumstimulatieplaat voor door 0,5 g natriumbicarbonaat vers op te lossen in 50 mL vijf x thalliumstimulatiebuffer.

Voeg vervolgens 50 µL van de oplossing toe aan elke put van een polypropyleen 384-wellplaat. Nadat de cellen zijn geladen met flus in 2:00 AM, wordt de plaat gewassen met een ELX 405 microplate washer. Voeg daarna 20 µL of 40 µL HBSS assay-buffer toe aan elke put; de plaat is nu gereed voor de experimenten.

Plaats de thallium- en celplaten in een Hema Matsu functioneel drug-screening-systeem of een vergelijkbare kinetische imaging plate reader met geïntegreerde mogelijkheden voor vloeistofdosering en gebruik geschikte filters voor fluoresceïne-gebaseerde kleurstoffen zoals flu oh four. Stel vervolgens een 'single add'-protocol in om 10 µL van de vijf X Thallium-serie toe te voegen aan de overeenkomstige putjes van de celplaat die 40 µL HBSS assaybuffer bevat. Registreer daarna de basislijnfluorescentie bij een bemonsteringsfrequentie van 1 Hz gedurende ten minste 10 seconden.

Zodra de optimale omstandigheden voor het uitplaten van cellen, wassen en laden zijn vastgesteld, moet de fluorescentie van putje tot putje uniform en stabiel zijn over de gehele plaat. Voeg ondertussen met de geïntegreerde 384-kanaals pipetteur de thallium-stimulatiebuffer simultaan aan elk putje toe en zet de opname voort gedurende ten minste twee minuten, zodat de snelheid en de piek van de door thallium geïnduceerde toename in fluorescentie worden vastgelegd voor offline analyse. Evalueer in de volgende reeks experimenten de uniformiteit en reproduceerbaarheid van de assay door in een 384-wells plaat een controle-inhibitor in elk tweede putje van elke kolom en rij uit te platen en voeg DMSO toe aan de overige putjes als vehicle-controle.

Gebruik een multichannelpipetteur. Maak een DMSO-plaat met verbindingen door een remmer van het doel-KIR-kanaal in de eerder bepaalde concentratie in een hoeveelheid van 80 microliters per well en 0,1% DMSO-vehikel in een polypropyleen 384-wells plaat te pipetteren. Dit gebeurt door een bekende remmer toe te voegen, beginnend bij well A1, afwisselend naar well B2, enzovoort tot aan well B24.

Herhaal deze procedure met DMSO, beginnend bij well B1 en ga zo door tot well A24. Plaats nu de platen met cellen, de verbindingen en de thalliumstimulus in de platenlezer. Stel vervolgens een protocol in om 20 µL van de 2X geconcentreerde serie verbindingen toe te voegen aan de overeenkomstige wells van de celplaat die 20 µL HBSS-assaybuffer bevatten.

Voeg de verbindingen toe aan de celplaat en incubeer deze tot 20 minuten bij kamertemperatuur. Registreer de basislijnfluorescentie gedurende ten minste 10 seconden. Voeg vervolgens 10 µL van vijf x thalliumbuffer toe aan elke well van de celplaat.

Herhaal het experiment op drie opeenvolgende dagen om de reproduceerbaarheid van de resultaten vast te stellen. Gebruik thalliumflux in DMSO en met medicijnen behandelde cellen om een waarde voor Z-prime te berekenen. Z-prime is een statistische maat voor de variabiliteit tussen de wells van de twee populaties wells; bereken Z-prime met deze formule op basis van de gemiddelden en standaarddeviaties van P en N, waarbij P de ongeremde fluxwaarde is en N de volledig geremde fluxwaarde.

Een assay met ZPrime-waarden groter dan of gelijk aan 0,5 op drie verschillende dagen wordt beschouwd als geschikt voor high-throughput screening. Deze figuren zijn enkele voorbeelden van de celplaatkaarten die in verschillende soorten experimenten worden gebruikt. De posities van de wells met niet-geïnduceerde of met tetracycline geïnduceerde cellen zijn in verschillende kleuren aangegeven.

Deze figuur toont de kaart van de bronplaat die is gebruikt om de optimale thalliumconcentratie voor de assay-ontwikkeling en compound-screening te bepalen. De kleurgradiënt stelt de drievoudige verdunningsreeks voor, variërend van 100% tot 0,002% thallium, en hier is een representatieve fluorescentie-intensiteitskaart met kleuren van koel naar warm, wat lage tot hoge thalliumfluxwaarden aangeeft. De hier getoonde kaart van de celuitplating, met een fit van een vierparameter logistieke functie op de thallium CRC, wordt gebruikt om een EEC 80-waarde van 15% thallium te bepalen.

Deze figuur toont de kaart van de bronplaat die is gebruikt om de DMSO-tolerantie van een assay te bepalen. Kolommen 1 en 24 bevatten alleen assaybuffer, terwijl het kleurverloop de tweevoudige verdunningsreeks aangeeft die varieert van 10% tot 0,01% DMSO; hier is een representatieve kaart van de fluorescentie-intensiteit waarbij lage thalliumfluxwaarden met donkerblauw zijn aangegeven. De gemiddelde thalliumfluxwaarden die zijn geregistreerd uit de wells met de aangegeven DMSO-concentraties zijn hier samengevat.

Deze figuur toont de kaart van de bronplaat die is gebruikt om concentratie-responskurves vast te stellen voor de bekende remmers van een KIR-kanaal. Elke verbinding is aangegeven met een verschillende kleur en is doorgaans aangebracht als een drievoudige verdunningsreeks. Hier wordt een representatieve kaart van de fluorescentie-intensiteit getoond, en deze figuur illustreert de dosisafhankelijke remming van de thalliumflux door de remmer na ontwikkeling en optimalisatie.

De thalliumflux-assay kan ook worden gebruikt voor het uitvoeren van diverse routinematige farmacologische assays. De thalliumflux-assay is eerder aangepast voor gebruik bij spanningsgestuurde en liganden-gestuurde kaliumkanalen, niet-selectieve kationkanalen en zelfs kaliumtransporters. Vergeet niet dat het werken met thallium uiterst gevaarlijk kan zijn; er moeten altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure, zoals het gebruik van handschoenen en een passende afvalverwerking.