Methodologie voor de studie van horizontale genoverdracht in Staphylococcus aureus
10 maart 2017
We beschrijven hier drie verschillende protocollen voor de in vitro onderzoek conjugatie, transductie en natuurlijke transformatie in Staphylococcus aureus.
Het algemene doel van deze procedure is om een gedetailleerde methodologie te bieden voor het bestuderen van de horizontale overdracht van DNA in staphylococcus aureus door de drie belangrijkste overdrachtsroutes aan te pakken. Conjugatie, transductie en natuurlijke transformatie. Deze methode gaat over de horizontale overdracht van antibioticaresistentiegenen in de humane pathogeen staph aureus.
Het grote voordeel van de hier geïntroduceerde technieken is dat we drie belangrijke overdrachtsmodi kunnen testen, inclusief onlangs ontdekte natuurlijke genetische transformatie. Het demonstreren van de procedure zal Le Thuy zijn, een promovendus uit ons lab. Om het experiment te beginnen, bereidt u vijf milliliter overnachtelijke cultuur van de donor- en de ontvangende bacteriën in tryptische sojabrood. Of TSB-medium met en zonder 32 milligram per liter chlooramfenicol, respectievelijk.
Met schudden bij 37 graden Celsius. De volgende dag, pas de optische dichtheid van de overnachtelijke culturen aan tot een met vers TSB-medium. Meng 0,5 milliliter van de donorcultuur met 0,5 milliliter van de ontvangende cultuur.
En voeg een milliliter fosfaat gebufferde zoutoplossing of PBS toe aan het mengsel. Gebruik vervolgens een vacuümpompsysteem om het mengsel van bacteriën over te brengen op een 0,45 micrometer filtermembraan. Plaats de filtermembranen op een schapenbloed agarplaat.
Incubeer de platen bij 37 graden Celsius gedurende één dag. Neem de filtermembraan uit de plaat en schors het in 10 milliliter PBS. Vortex het mengsel gedurende ongeveer een minuut om alle bacteriën die op het membraan zijn bevestigd te verzamelen.
Maak een seriële 10-voudige verdunning van de bacteriële suspensie met vers TSB. Plateer 100 microliter van de 0, 10, 4 verdunde monsters op TSB agar. Of TSA-platen aangevuld met 32 milligram per liter chlooramfenicol en acht milligram per liter tetracycline om transconjuganten te selecteren.
Plateer 100 microliter van de verdunde suspensie op TSA-platen met alleen acht milligram per liter tetracycline. Om het totale aantal ontvangers te tellen. Na incubatie, analyseer dubbel resistente kolonies op de aanwezigheid van het CFR-gen door kolonie PCR en hun gevoeligheidsprofielen.
Bepaal het antibiogram door de minimale remmende concentraties, MIC's, van geschikte antibiotica te meten volgens de standaard microdilutiemethode of schijfdiffusiemethode. Het gevoeligheidsprofiel van de transconjuganten moet identiek zijn aan de ontvanger. Behalve voor chlooramfenicol en andere verbindingen die worden beïnvloed door het CFR-gen.
Om tetracyclineresistentie ontwikkeld door de donorstammen uit te sluiten. Bereid een overnachtelijke cultuur van N315-45 in vijf milliliter voedingsbouillon aangevuld met 3,6 millimolair calcium. Bereid subculturen door de overnachtelijke cultuur een tot 1.000 te verdunnen in een eindvolume van 10 milliliter in glazen flesjes van 50 milliliter.
Laat de bacteriën een uur groeien bij 37 graden Celsius met schudden, 180 rotaties per minuut. Bereid vervolgens een reeks verdunde fagen MR83a in NB calciumchloride medium. Voeg 20 microliter van de verdunde faag toe aan de bacteriecultuur.
Bereid een controlecultuur zonder faaginfectie om als positieve controle voor bacteriecelgroei te dienen. Laat vervolgens de culturen groeien bij 37 graden Celsius met zacht schudden bij 100 rotaties per minuut overnacht. De volgende dag selecteert u één of twee opgeruimde kweekflessjes met de hoogste verdunning van de toegevoegde faag.
Breng de culturen over in 15 milliliter centrifugeerbuisjes. Voeg 250 microliter chloroform toe aan de buisjes en meng de cultuur grondig door ze om te keren. Centrifugeer de cultuur bij 5.000 keer G gedurende 20 minuten bij 4 graden Celsius.
Breng de supernatanten over in verse buisjes en bewaar ze bij 4 graden Celsius tot gebruik. Bereid voedingsbouillon agar medium en houd het warm in een waterbad van 55 graden Celsius. Voeg autoclaved 0,5 molair calciumchloride-oplossing toe aan het medium tot een eindconcentratie van 3,6 millimolair.
Giet het in 90 millimeter petrischalen NB calciumchloride platen. Bereid een overnachtelijke cultuur van N315 in vijf milliliter NB calciumchloride bij 37 graden Celsius met schudden. De volgende dag voegt u 10 microliter van de overnachtelijke cultuur toe aan 200 microliter NB calciumchloride en verdeelt het gelijkmatig over de NB calciumchloride plaat.
Stop met verspreiden wanneer het oppervlak van de plaat bedekt is met vloeistof. Laat de plaat vervolgens vijf minuten drogen. Maak een seriële een tot tien verdunning van de eerder bereide fagen met behulp van NB calciumchloride medium.
Plek drie microliter van elke fagenverdunning op de met bacteriën bedekte plaat. Incubeer de plaat overnacht bij 30 graden Celsius. De volgende ochtend, tel de plaquenummers en bereken de faagtiter met behulp van de volgende vergelijking.
Bereid de overnachtelijke cultuur van N315, COL of MU50, in vijf milliliter NB calciumchloride bij 37 graden Celsius met schudden bij 180 rotaties per minuut. Na overnachtelijke cultuur, verdun de faag in NB calciumchloride tot 109 PFU per milliliter. In een glazen flesje van 50 milliliter, meng 500 microliter overnachtelijke cultuur, 500 microliter vers NB calciumchloride en een milliliter faag 109 PFU per milliliter.
Incubeer het mengsel bij 37 graden Celsius met zacht schudden bij 100 rotaties per minuut gedurende 30 minuten. Voeg na incubatie 50 microliter 20% trinatriumcitraat toe aan de culturen. Ga door met zacht schudden gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius.
Bereid het gesmolten hersenhartinfusie of BHI agar medium en houd het in een waterbad van 55 graden Celsius, en behandel het agarmedium met 32 milligram per liter chlooramfenicol. Breng vervolgens het bacteriefaagmengsel over in een 100 milliliter kolf. Voeg 50 milliliter warm BHI agar aangevuld met 32 milligram per liter chlooramfenicol toe en meng goed.
Giet het mengsel in de 90 millimeter petrischalen. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius. Test ver
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert drie protocollen voor het onderzoeken van de horizontale overdracht van DNA in Staphylococcus aureus via conjugatie, transductie en natuurlijke transformatie. Deze methoden richten zich op de overdracht van antibioticaresistente genen in dit menselijke pathogeen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiologie
- Genetica
- Antibioticaresistentie
Achtergrond
- Staphylococcus aureus is een belangrijke humane pathogeen.
- Horizontale genoverdracht is een sleutelmechanisme voor de verspreiding van antibioticaresistentie.
- Inzicht in de verschillende routes van DNA-overdracht kan bijdragen aan behandelstrategieën.
- Recente ontdekkingen op het gebied van natuurlijke transformatie vergroten onze kennis over genetische uitwisseling.
Doel van de studie
- Het bieden van gedetailleerde methodologieën voor het bestuderen van DNA-overdracht in Staphylococcus aureus.
- Het verkennen van de drie belangrijkste routes van horizontale genoverdracht.
- Het demonstreren van de protocollen door een PhD-student uit het laboratorium.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van overnight-culturen van donor- en recipiëntbacteriën.
- Gebruik van tryptic soy broth (TSB) met en zonder chloramphenicol.
- Toepassing van protocollen voor conjugatie, transductie en natuurlijke transformatie.
- Beoordeling van de overdracht van antibioticaresistentiegenen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle demonstratie van de drie DNA-transfermethoden.
- Inzichten in de efficiëntie van natuurlijke transformatie bij Staphylococcus aureus.
- Gegevens die de rol van horizontale genoverdracht bij antibioticaresistentie ondersteunen.
- Vestiging van een betrouwbaar experimenteel kader voor toekomstige studies.
Conclusies
- De beschreven protocollen zijn effectief voor het bestuderen van DNA-overdracht in Staphylococcus aureus.
- Het begrijpen van deze mechanismen is essentieel voor het aanpakken van antibioticaresistentie.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze methodieken om andere pathogenen te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Het begrijpen van de mechanismen van horizontale genoverdracht in Staphylococcus aureus is cruciaal voor het voorspellen van de evolutie van resistentie en het informeren van strategieën voor de ontwikkeling van antimicrobiële middelen. De beschreven protocollen maken een mechanische risicobeperking van resistentieverspreidingspaden mogelijk, wat bijdraagt aan de voorspellende betrouwbaarheid bij preklinische targetvalidatie. Dit werk biedt een gestandaardiseerd kader voor het evalueren van genetische uitwisseling in een belangrijke nosocomiale pathogeen, wat direct invloed heeft op vroege ontdekkingsbeslissingen met betrekking tot anti-infectieve pipelines.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen over verspreidingsmechanismen van resistentiegenen mogelijk.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar systeem voor functionele validatie van genetische transferpaden in klinisch relevante stammen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de beoordeling van het risico op resistentieverwerving, wat bijdraagt aan de selectie van targets en de prioritering van de portfolio.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve resultaten van de overdrachtsefficiëntie bij conjugatie, transductie en natuurlijke transformatie.
- Operationele waarde: Stelt gestandaardiseerde condities vast voor de reproduceerbaarheid van de assay en vergelijkbaarheid tussen laboratoria.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt aanpassing aan high-throughput screeningformaten voor de identificatie van resistentie-remmers.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppelt mechanismen van genetische overdracht aan fenotypische resistentie-uitkomsten, wat preklinische modellen mogelijk maakt die zijn afgestemd op biomarkers.
- Operationele waarde: Faciliteert de continuïteit van mechanistische ontdekking naar preklinische validatie van interventies tegen resistentie.
- Risicobeperking: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door de dynamiek van de verspreiding van resistentie in ziekterelevante systemen te verduidelijken.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methodologie integreert in vroege ontdekkingsworkflows door hypothesetoetsing van resistentiemechanismen mogelijk te maken, lead-identificatie te informeren via de beoordeling van resistentierisico's en de preklinische evaluatie van verbindingen die gericht zijn op genetische uitwisseling te ondersteunen.
- Discovery Biology: Ondersteunt het mechanistisch verminderen van risico's door te verduidelijken hoe resistentiegenen tussen stammen bewegen, wat de ambiguïteit bij targetvalidatie vermindert.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare metingen van de frequentie van gentransfer onder gestandaardiseerde omstandigheden.
- Analytics: Biedt readouts op basis van kolonie-PCR en MIC die een vergelijkende analyse van de transferefficiëntie over verschillende experimentele condities mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt laboratoriumobservaties van HGT met klinische surveillancedata, wat de afstemming van translationele biomarkers ondersteunt.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een modulair platform dat aanpasbaar is aan meerdere donor-recipient stammenparen en resistentiegenen naast cfr.
Operationele en organisatorische impact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in resistentie-evolutie, waardoor het vertrouwen in doelhypothesen toeneemt.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid over conjugatie-, transductie- en transformatie-assays.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door het risico op resistentieverwerving vroeg in de ontdekkingsfase te kwantificeren.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van anti-infectieve kandidaten mogelijk op basis van het potentieel voor resistentieverspreiding.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in microbiologische technieken, waaronder steriel werken, filtratie en antibioticaselectie.
- Is afhankelijk van toegang tot anaerobe werkstations, incubatoren en apparatuur voor faagtitering en DNA-manipulatie.
- Vereist standaardisatie tussen teams van kweekcondities, antibioticaconcentraties en uitleesprotocollen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij het uitbreiden van protocollen naar andere Gram-positieve pathogenen of milieu-isolaten.
- Wordt beperkt door de noodzaak van isogene stam paren en bevestiging van de afwezigheid van achtergrondresistentie in donorstammen.
