Doe-het-zelf-Inrichting voor Herstel van gecryopreserveerde monsters per ongeluk laat vallen in cryogene opslagtanks

Het doel van deze procedure is om het terugvinden van monsters in cryoboxen en cryovials uit duotanks gevuld met vloeibare stikstof te vergemakkelijken met behulp van een eenvoudig te construeren hulpmiddel. Dit wordt bereikt door eerst één of twee vriesrekken uit de tank te verwijderen om ruimte te creëren voor manoeuvreren en om het hulpmiddel verticaal in de tank te kunnen plaatsen. De tweede stap is om met het hulpmiddel voorzichtig langs de bodem van de tank te schrapen.

Trek het apparaat vervolgens rechtop langs de wanden van de houder. Om de vriesbox uit het reservoir te scheppen, is de laatste stap om de box die van de bodem van de houder is opgehaald te pakken en de verwijderde vriesrekken terug te plaatsen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals decanteren of het gebruik van een staaf met vloeibare stikstof is dat het een eenvoudig, veilig en snel alternatief biedt, waardoor de integriteit van de monsters behouden blijft en de procedure door één operator kan worden uitgevoerd. Om te beginnen met de assemblage van het cryotolerante apparaat, gebruik dan een tang om één zijde van een driezijdige kabelbinder recht te buigen om een L-vormige kabelbinder te maken.

Zoals hier te zien is, kunnen de afmetingen van de stevige binding worden gekozen op basis van de diameter van de hals van de doer. Er moeten twee van deze stevige bindingen worden gemaakt om het apparaat in staat te stellen cryoboxen van 5,5 bij 5,5 inch op te halen. Bevestig deze met een TST-band voor stevige binding met behulp van een kroonbout, moer, ring en schroef om de basis van de cryoschep te vormen.

Het apparaat zou er nu uit moeten zien zoals hier wordt getoond. Lijn nu, met behulp van een geperforeerde plaat, de sleuven van de T-stuk-bevestigingsstrip uit met de sleuven aan één uiteinde van de geperforeerde plaat. Bevestig vervolgens beide delen aan elkaar met Hillman-moeren en -bouten.

Boor gaten voor de bevestiging als de geperforeerde plaat en stevige riemen geen voorgeboorde gaten hebben. Indien gewenst kan er een handgreep worden gevormd door het andere uiteinde van de geperforeerde plaat te buigen en in schuimrubber te wikkelen. Om het apparaat beter vast te kunnen pakken, dient het schuimrubber vóór het reinigen met water te worden verwijderd.

Het cryotolerante DIY-ophaalapparaat kan ook worden aangepast voor het ophalen van cryovials. Dit houdt in dat de vlakke basis wordt vervangen door een zeef van roestvrij staal die is aangepast om vials uit vloeistof te scheppen. Om met de assemblage te beginnen, draai je eerst de kroonmoeren en bouten los en bevestig je de stevige band van autobandrubber aan de geperforeerde plaat.

Buig vervolgens, voordat u de roestvrijstalen zeef aan de geperforeerde plaat bevestigt, voorzichtig de hals van de zeef met behulp van een tang, zodat de basis onder een hoek komt te staan en op een pollepel lijkt. Als de gebruikte zeef over een rand beschikt, gebruik dan een tang om deze rand naar beneden te buigen. Dit maakt het manoeuvreren met het apparaat eenvoudiger.

Lijn het gat in het handvat van de zeef uit met de gaten in de geperforeerde plaat en bevestig de zeef met Hillman-moeren en -bouten. Boor gaten als de zeef niet is voorzien van voorgeboorde gaten. Voordat u begint met het uitnemen van cryoboxen uit een doer, dient u eerst cryogene handschoenen aan te trekken.

Verwijder vervolgens één of twee vriesrekken uit de container om ruimte te maken voor het manoeuvreren met het apparaat. Gebruik daarna het rechtopstaande, cryotolerante DIY-ophaalapparaat, uitgerust met de sterke tie-ttra-basis, om voorzichtig langs de bodem van de container te schrapen en de box op te vangen die op de bodem van de containertank is gevallen. Trek vervolgens het apparaat langs de wanden van de container omhoog om de vriesbox uit de tank te scheppen.

Let op dat het apparaat verticaal moet worden vastgehouden en recht omhoog getrokken om te voorkomen dat de box terug in de doer glijdt. Om cryovials te terughalen, gebruikt u de cryoschep die is voorzien van een zeef om voorzichtig over de bodem van de doer te schrapen, vergelijkbaar met het terughalen van de cryobox; trek het apparaat rechtop en pak de vials die in de zeef zijn verzameld. Een grote uitdaging bij genexpressiestudies is dat de kwaliteit van RNA afhankelijk is van de opslagcondities voor zowel bevroren weefselmonsters als geëxtraheerd RNA.

Deze figuur laat het effect van monsterverwerking zien op de integriteit van totaal RNA; totaal RNA uit dezelfde weefselbron werd vóór het experiment aan verschillende monsterverwerkingsmethoden onderworpen. Intact totaal RNA vertoont duidelijke 28 S en 18 S ribosomaal RNA-banden, waarbij de 28 S ribosomaal RNA-band ongeveer twee keer zo intens is als de 18 S ribosomaal RNA-band. Dit is een indicatie dat het RNA intact is. Baan drie en vier tonen monsters met significante degradatie als gevolg van herhaaldelijk gedeeltelijk ontdooien door kortstondige verwijdering uit de vriezer, waarmee langdurige bewaring met periodieke ontdooiing wordt gesimuleerd vanwege de noodzaak om gevallen vials uit dozen te halen.

Echter, monsters die in de doer-service zijn bewaard met behulp van het DIY-apparaat en dus geen gedeeltelijke ontdooiing hebben ondergaan, bevatten intact RNA in baan twee. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u monsters uit de met vloeibare stikstof gevulde dvar kunt halen zonder dat het nodig is om deze leeg te gieten.