Het creëren van Defined Gasvormige omgevingen om de gevolgen van hypoxie Studie naar

Het doel van het volgende experiment is het opzetten en onderhouden van een hypoxiekamer met behulp van een methode met continue doorstroming. Dit wordt bereikt door de benodigde buizen, kolven en kamers voor de procedure te verkrijgen en te vervaardigen. Sluit vervolgens de zuurstoftank aan en selecteer de stroomsnelheid om het gewenste niveau van hypoxie te creëren.

Hydrateer het gas door het door een bellenkolf gevuld met gedeïoniseerd water te leiden. Verbind het gehydrateerde gas met de hypoxiekamer en plaats de testmonsters in de kamer om ze bloot te stellen aan hypoxische omstandigheden. De resultaten tonen Hi F1-afhankelijke embryonale letaliteit bij hypoxie aan op basis van de observatie van de levensvatbaarheid tot aan de volwassen leeftijd.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals gloveboxen, is dat deze eenvoudig en goedkoop in het laboratorium te vervaardigen is en een nauwkeurige en reproduceerbare gasconcentratie in de omgevingskamer biedt. Hoewel deze methode inzicht geeft in de hypoxische respons bij de nematode C elegance, kan deze ook worden aangepast voor andere systemen, waaronder grotere modelorganismen en celculturen. Daarnaast kan het worden gebruikt om andere gassen te bestuderen, waaronder kooldioxide en waterstofsulfide.

Dit protocol demonstreert hoe een hypoxiekamer kan worden geconstrueerd. Gas wordt bewaard in persgasflessen met gedefinieerde zuurstofconcentraties, waaraan een tweetrapsregelaar is bevestigd. Het gas treedt binnen aan de onderzijde van de doorstroombuis en verlaat deze aan de bovenzijde met de juiste stroomsnelheid.

Het gas stroomt vervolgens de borrelkolf in, waardoor het gas gehydrateerd wordt. Het gas stroomt daarna via de inlaatklep de hypoxiekamer in, waardoor de monsters worden blootgesteld aan hypoxie. Ten slotte ontsnapt het gas via een in de kamer geboord uitlaatgat naar de ruimte.

Een Pyrex crystallisatieschaal of een arrow pack-doos kan worden gebruikt als behuizing voor de omgevingskamer. Het volume van de container moet tot een minimum worden beperkt en het materiaal moet gasdicht zijn. Boor met een koolstof- of diamantboor een gat in één zijde van de container en plaats hierin een plastic slangnippel.

Meng de epoxy voordat deze op de box en de koppeling wordt aangebracht. Herhaal vervolgens dezelfde procedure aan de tegenovergestelde zijde van de container, waarbij het tweede gat ten opzichte van het eerste is verschoven. Om de turbulente menging te verhogen, dient FEP- of nylonbuis met een buitendiameter van one eighth inch te worden gebruikt om de samengeperste gastanks aan te sluiten op een debietregelaar, zoals een massaflowcontroller of een rotameter.

De gasflessen moeten gedefinieerde zuurstofconcentraties hebben, gebalanceerd met stikstof, conform een gecertificeerde standaard voor zuurstofgehalte of voor anoxische condities. Gebruik voor pure stikstof een tweetrapsregelaar waarbij de tweede trap is ingesteld op de gewenste druk. Raadpleeg de instructies in het schriftelijke protocol voor het selecteren van een geschikte stroomsnelheid.

Sluit vervolgens de slang van de tweetrapsregelaar aan op de debietregelaar die de stroomsnelheid van het gas dat de kamer binnenkomt, beheert. De uitgangen van de debietregelaar worden aangesloten op een gaswasfles met een gesinterde cilinder met gedestilleerd water. Sluit vervolgens de slang aan de andere zijde van de wasfles aan op een van de koppelingen van de milieukamer.

Dit zal het gas bevochtigen dat de milieukamer binnenkomt. Gebruik vacuümvet om de kamer af te dichten. Plaats vervolgens gewichten op het deksel van de kamer om een luchtdichte afsluiting te garanderen.

Test de afdichting door een kleine hoeveelheid water in de palm van een gehandschoende hand tegen de gasuitlaatkoppeling van de kamer te houden en te controleren op bellen. Genereer vervolgens gesynchroniseerde populaties van sea Elgan. Plaats één tot 100 GR-volwassenen in een druppel alkalische bleekoplossing op het oppervlak van een onbezaaide kweekplaat voor nematoden.

Laat de bleekoplossing na een incubatieperiode van ten minste acht uur in de plaat trekken. Breng de gesynchroniseerde L1-larven over naar een plaat waarin levende OP 50-bacteriën zijn gezaaid. Laat alternatief GRA-volwassenen gedurende twee tot drie uur eitjes op de plaat leggen om een groep wormen te genereren die synchroon zullen ontwikkelen, of selecteer L4-larven uit een gemengde populatie om jonge embryo's te verzamelen.

In het twee- tot viercelstadium worden de volwassen GR-wormen met een scheermesje gehakt in een klein volume water, waarna de embryo's met een mondpipet worden overgebracht voordat de wormen op de plaat worden geplaatst voor blootstelling aan hypoxische condities. Plaats een ring van 10 mg/mL palmitinezuur in ethanol langs de rand van de platen om te voorkomen dat de wormen van het oppervlak van de agarplaat ontsnappen.

Het palmitinezuur zal neerslaan uit de oplossing. Terwijl de ethanol verdampt en een fysieke barrière vormt om uniformiteit te waarborgen, dient u ervoor te zorgen dat het water in de gaswasfles wordt vervangen vóór blootstelling in de environmental chamber. Nadat de wormen naar de platen zijn overgebracht, sluit u de platen af in de environmental chamber, start u de gasstroom en houdt u de blootstelling gedurende de gewenste tijd voor de assay in stand.

Om de levensvatbaarheid van embryo's tot in de volwassen fase te bepalen, laat u de wormen 48 uur lang ontwikkelen na terugkeer naar kamertemperatuur, waarna ze vierde-stadium larven of eendagse volwassenen zouden moeten zijn; score vervolgens de levensvatbaarheid tot volwassenheid. Om wormen die zijn blootgesteld aan hypoxie te visualiseren, brengt u de wormen over naar een druppel M9 op een vierkant dekglas van 22 millimeter en plaatst u dit indien nodig omgekeerd op een kussentje van 2% agarose in M9.

Voor anesthesie kan 25 millimolair amol of 10 millimolair natriumazide worden gebruikt. Alternatief kan de transparante omgevingskamer na blootstelling aan hypoxie direct op de tafel van een dissectiescoop worden geplaatst. Er worden twee weergaven getoond, waarvan één de volledige opstelling voor de gasstroom omvat.

De andere met alleen de kamer op de objecttafel van de microscoop. Kweek Bristol N2 wormen op vier growth plates van 10 centimeter hoog totdat de meerderheid van de wormen GR-volwassenen zijn. Was de wormen in een conische buis van 15 milliliter met een alkalische bleekoplossing van 1:5 en incubeer deze onder rotatie totdat de wormen beginnen op te lossen.

Niet langer dan vijf minuten. Was de wormen drie keer met M9 door ze tussen elke wasbeurt te centrifugeren bij 1.500 ×g, zonder de plaat te breken. Verdeel de gebleekte embryo's over 8 NGM-platen van 150 millimeter en laat de embryo's gedurende ongeveer 48 uur uitgroeien tot L4-larven.

Plaats de platen bij 22 °C in de environmental chamber en stel ze vier uur lang, of voor de duur die in het experimentele ontwerp is gespecificeerd, bloot aan hypoxische en anoxische omstandigheden. Verwijder voor het oogsten van de monsters snel het deksel van de hypoxische kamer. Neem één monsterplaat, sluit de kamer direct weer en noteer de stappen.

Na het verwijderen van de wormen uit de hypoxie moet dit gehele proces minder dan twee minuten duren. Gebruik gedestilleerd water om de wormen op een nylon filter te wassen en giet ze vervolgens in een gelabelde conische buis van 15 milliliter die 100 µL van 1% SDS bevat. Centrifugeer de wormen in SDS in een desktopcentrifuge op 1.500 ×g gedurende 15 tot 20 seconden.

Gebruik na het breken een vacuüm om het grootste deel van het supernatant uit de buis te verwijderen, waarbij het wormpellet ongemoeid blijft. Draag het wormpellet met een vooraf bepaald volume vloeistof met een pipet over naar een gelabelde 1,5 µL microcentrifugebuis. Indien het monster wordt gebruikt voor SDS-PAGE, kan deze buis een gelijk volume van twee keer geconcentreerde proteïnelaadkleurstof bevatten; sluit de buis en dompel deze onder in vloeibare stikstof.

Herhaal dit totdat alle monsters zijn geïsoleerd. Volg deze procedures ook voor luchtcontroles van het huis voor de consistentie; monsters kunnen worden bewaard bij -20 °C. Deze figuur toont de levensvatbaarheid van embryo's die zijn blootgesteld aan 1000 ppm zuurstof, 5000 ppm zuurstof en normoxie rond de 210.000 ppm zuurstof.

De embryo's worden gedurende 24 uur aan elke conditie blootgesteld in zuurstofkamers met continue doorstroming. De wormen werden overgebracht naar normoxische condities, waar ze 48 uur lang mochten uitgroeien tot volwassenen, waarna de levensvatbaarheid tot volwassen stadium werd gescoord. Na deze procedure kunnen monsters worden verzameld voor verdere analyse via Western blot, QPCR of fysiologische assays, zoals levensduur of nakomelingenproductie.

Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u een continue flow hypoxiekamer in uw eigen laboratorium kunt opzetten.