Generation, Zuivering en karakterisering van Cell-invasieve DISC1 Protein Soorten

Het algemene doel van de volgende procedures is het genereren van gezuiverde schijf-aggregaten die in staat zijn om recipiënte cellen binnen te dringen. Met de eerste methode worden twee verschillende manieren gedemonstreerd om dit doel te bereiken.

Het fluorescent eiwit-fusie-eiwit disc one, dat somen vormt, wordt overgeëxpresseerd in NLF menselijke neuroblastoom-donorcellen. De cellen worden vervolgens gewassen met PBS, verzameld en gelyseerd zonder gebruik van detergentia. Het DNA wordt gedigesteerd en agro-zones worden gezuiverd met behulp van een sucrosegradiënt-systeem.

Agrios die met deze methode zijn gezuiverd, vertonen een lage efficiëntie bij celinvasie. Een alternatieve benadering is om de aminozuren 5 98 tot 7 85 van het recombinante disc one-eiwit in e coli over te expresseren. Het eiwitfragment wordt vervolgens gelabeld met DITE 5 94, gedialyseerd en gezuiverd met behulp van een NI NTA-matrix, waarmee alle resterende ongebonden kleurstof en multimeer disc worden verwijderd.

Fragmenten die met deze methode zijn gegenereerd, vertonen een hoge celinvasie-efficiëntie voor het beoordelen van de invasie van gastcellen. Gebruik hiervoor ofwel de gezuiverde fluorescente eiwitdisc, ribosomen of de gelabelde recombinante disc. De fragmenten worden geïncubeerd met de betreffende recipiënte cellen.

Vervolgens wordt Trian blue toegevoegd om de extracellulaire fluorescentie te doven en de invasie wordt gevisualiseerd met confocale microscopie. Tot nu toe is eiwitaggregatie geen erkend kenmerk geweest van chronische mentale ziekten zoals schizofrenie. Waar bij schizofrenie één eiwit een kandidaat is voor verstoring, is de cellulaire invasiviteit van eiwitaggregaten een kenmerkend aspect van eiwitconformationele ziekten.

Hier tonen we met twee methoden aan dat aggregaten van het disc1-eiwit cel-invasief zijn en dat disc1-gerelateerde aandoeningen of disc1-neuropathieën derhalve eiwitconformatieziekten zijn. De twee methoden bestaan enerzijds uit de zuivering van full-length disc1-SOS uit neuroblastoomcellijnen en anderzijds uit de expressie van een C-terminaal multimeer disc1-fragment in E. coli, evenals de zuivering en labeling met een fluorescente kleurstof.

Waar de eerste methode slechts leidt tot een lage efficiëntie van celinvasie, waarbij ongeveer 0,3% van de cellen de gezuiverde microsomen opneemt, infecteert het zuivere recombinante eiwitfragment tot 20% van de blootgestelde cellen. De hier beschreven methoden zouden overdraagbaar moeten zijn op andere eiwitten waarbij acrosomevorming of multimere assemblage overtuigend is aangetoond. In elk van de 10 10 centimeter schalen.

Zaai 1,5 x 10⁶ menselijke neuroblastoom- en LF-cellen uit in aangevuld RPMI 1640-medium en laat deze een nacht groeien. De volgende dag moeten de cellen 70 tot 80% confluent zijn; label vijf kweekschalen voor transfectie met pcDNA 3.1 mRFP- en EGFP-gelabeld menselijk full-length DISC1 en vijf voor transfectie met alleen het EGFP-plasmide. Combineer voor elke schaal van 10 centimeter 15 µg plasmide-DNA, 30 µL Metafect en 750 µL.

Voeg Opti MEM toe in een microcentrifugebuis en meng door herhaaldelijk op en neer te pipetteren, en laat dit 20 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens, om de cellen te transfecteren, de DNA-transfectiereagensoplossing druppelsgewijs toe aan de cellen. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO₂. Controleer 48 uur na transfectie de expressie van MRFP full length disc one en bevestig de vorming van aggresomen onder een fluorescentiemicroscoop. Sommige cellen bevatten massieve fluorescentie-eiwitaggregaten, zoals hier getoond.

Dit protocol combineert een methode voor het zuiveren van Lewy-lichaampjes uit hersenweefsel met het protocol voor het isoleren van grotere aggregaten of agro-zones; aangezien bestaande methoden gebaseerd zijn op het gebruik van detergentia, is de isolatie van detergentvrije eiwitten cruciaal voor de toepassing in assays voor celinvasiviteit. Aspireer vervolgens het medium, was met PBS en voeg 400 µL PBS toe dat een protease-remmercocktail bevat. Schraap daarna de cellen af en voeg één mL celсусpensie en 10 keramische kraaltjes toe aan een lysisbuis van twee mL.

Lyseren de cellen met drie pulsen van 62 seconden in een pre-cell lyse 24 homogenisator. De mechanische kracht van dit proces kan de temperatuur in het monster doen stijgen tot boven de 37 °C. Daarom moet er zorgvuldig worden toegezien dat het monster op ijs wordt gekoeld. Voeg na de lyseprocedure, nadat de cellen op ijs zijn afgekoeld, 10 millimol magnesiumchloride en 40 units per milliliter DNAA toe en incubeer dit 60 minuten bij 37 °C onder schudding.

Bereid telkens 10 milliliter van 80%, 50% en 20% sucrose (gewicht per volume) in PBS voor. Bereid vervolgens in een conische buis van 15 milliliter de sucrosegradiënt door te beginnen met twee milliliter 80% sucrose, gevolgd door twee milliliter 50% en twee milliliter 20% sucrose. Giet de gradiënt langzaam in en zorg ervoor dat de reeds gegoten lagen niet worden verstoord.

Laag vervolgens het gedigesteerde lysaat bovenop de gradiënt en centrifugeer 15 minuten bij 1000 ×g bij vier graden Celsius. Neem na het centrifugeren voorzichtig de interface tussen de 50 en 80% sucroselaag op met een pipet en meng dit met vijf volumes in een kegelvormige centrifugebuis van 15 milliliter; centrifugeer vervolgens 15 minuten bij 1000 ×g bij vier graden Celsius. Verwijder voorzichtig het supernatant en behoud het pellet dat de agri-zone bevat.

Herhaal het wassen nog twee keer in deze interface. Agri-zones zijn fluorescent en kunnen na de laatste wasbeurt onder UV-licht in de microscoop worden gevisualiseerd; verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in 250 tot 500 µL PBS. Dit pellet bevat de gezuiverde agro-zones.

Voeg 10 µL van de MRFP disc, one asome suspensie toe aan elke well van een 24-well plaat met SHSY five Y humane neuroblastoomcellen die constitutief oplosbaar GFP disc one C-terminus tot expressie brengen op steriele glazen dekglasjes en incubeer gedurende 48 tot 72 uur. Was de cellen drie keer met PBS en quench de extracellulaire fluorescentie met 0,04% trypan blue gedurende vijf minuten.

Was vervolgens met PBS om het trypaanblauw te verwijderen. Plaats daarna de schaal op ijs en voeg 4% PFA en PBS toe gedurende 10 minuten om de cellen te fixeren. Was vervolgens één keer met steriel water en monteer de dekglasjes op objectglazen met Prolong Gold DPI monteermedium.

Bevestig de opname bij invasie van exogeen toegevoegde aggro-zones door colocalisatie met gerekruteerde eiwitten die tot expressie komen door recipientcellen in Z-stack-beelden. Deze Z-stack heeft een diepte van ongeveer zes micrometer.

24 opnamen gemaakt met stappen van 200 nanometers. De fluorescentie van de MRFP disc one agri-zone, weergegeven in rood, rekruteert de cytosolische GFPC terminale disc. Eén fragment, weergegeven in groen, vertoont colocalisatie als geel en geeft aan dat de agri-zones het cytosol van de ontvanger zijn binnengedrongen en voorheen oplosbaar disc one-eiwit hebben gerekruteerd.

In dit deel van het protocol wordt human disc one gelabeld met DITE 5 94. Deze D maakt directe monitoring van het recombinante eiwit mogelijk zonder dat aanvullende immunokleuring nodig is. Begin met het vrijmaken van het eiwit, zoals voorbereid in het bijbehorende document, van beam mercaptoethanol door het drie keer te dialyseren in twee liter PBS bij een verdunning van 1 op 2000.

Label één milligram disc one met DITE 5 94 IDE; los één milligram per milliliter proteïne op in PBS en voeg vijf millimolar TCEP toe om vrije TH-groepen te herstellen. Voeg 20 microliters van de in DMF opgeloste kleurstof toe aan de reactie en incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Dialyseer de proteïne drie keer in PBS met een ratio van 1:2000 gedurende telkens twee uur, met behulp van een SLI-dialysecassette met een molecular weight cutoff van 10.000 Daltons, om de zuiverheid van de gelabelde proteïne verder te verhogen.

Er wordt een affiniteitszuivering op basis van een histidine-tag uitgevoerd op een Ni-NTA-kolom. Was één milliliter Ni-NTA-matrix met 10 milliliter PBS, breng vervolgens het gelabelde, gedialyseerde eiwit aan op de kolom en laat dit door de kolom lopen.

Langzaam zal de oplossing een deel van zijn blauwe kleur verliezen door de binding van het eiwit aan de NTA-matrix; ongebonden vrije kleurstof blijft in de doorstroomfractie aanwezig. Nadat de eiwitoplossing in de kolom is aangebracht, wordt de kolom drie keer gewassen met 20 milliliter PBS. Om het eiwit te elueren, worden twee milliliter PBS met 500 millimolar imidazol aan de kolom toegevoegd.

Stel de klep in op een lage snelheid en elueer druppelgewijs terwijl de gekleurde band op de Ni-NTA-kolom wordt gevolgd. Deze gekleurde fractie van het eluaat bevat het gelabelde recombinante eiwit. Draag het eluaat over naar een sliders-dialysecassette en dialyseer het eluaat drie keer tegen 10 millimolair NaPi bij een verdunning van 1:2000 gedurende telkens twee uur in twee liter. Pers het eluaat na dialyse door een steriel 0,45 micrometer spuitfilter, verdeel dit vervolgens in vijf monsters van 100 microliter en vries deze direct in met vloeibare stikstof.

De totale hoeveelheid eiwit moet 0,5 tot 1 µg per milliliter zijn in elk aliquot van 100 µL. Om de invasiviteit van het eiwit te beoordelen, wordt medium met 5 tot 10 µg per milliliter gelabeld recombinant Disc1-eiwit toegevoegd aan elke put van een 24-well plaat met ontvangende SH-SY5Y menselijke neuroblastoomcellen. Die het oplosbare GFP-tag Disc1 C-terminus constitutief tot expressie brengen op steriele glazen dekglasjes, incuberen gedurende 48 tot 72 uur.

Doof de extracellulaire fluorescentie, fixeer en monteer de cellen zoals gedaan is bij de met agri zone behandelde cellen; bevestig de invasie van het exogeen toegevoegde recombinante eiwit via Z-stack imaging. Wanneer het gelabelde eiwit wordt opgenomen, is dit detecteerbaar binnen de perimeter van de recipiënte cellen in beelden gegenereerd door confocale microscopie. Deze Z-stack omvat een diepte van ongeveer 5 µm over 24 stappen van 220 nm.

Hier wordt het recombinante disc1-fragment 598 tot 785, in het rood weergegeven, opgenomen door recipiënte cellen die het oplosbare C-terminale GFP-getagde disc1, in het groen weergegeven, tot expressie brengen om de invasiviteit van disc1-eiwitaggregaten te bepalen. Acrozonen bestaande uit MRFP-getagd full-length disc1 werden gezuiverd uit NLF-cellen en aangebracht op recipiënte SH-SY5Y-cellen zoals beschreven in dit protocol, zoals hier getoond. MRFP-getagde disc1-acrosomen infiltreerden een menselijke neuroblastoom SH-SY5Y-cel die oplosbaar GFP-getagd C-terminaal disc1 tot expressie bracht.

Bovendien was het MRFP-gelabelde disc one-asoom in staat om oplosbaar GFP-gelabelde disc one te rekruteren in onoplosbare aggregaten. Om de invasiviteit te bepalen, werd DIA-gelabeld recombinant disc one toegepast op SH-SY5Y neuroblastoomcellen die oplosbaar GFP-disc one tot expressie brachten, zoals hier wordt getoond. Recombinant disc one-eiwit (in het rood weergegeven) infiltreerde de ontvangende cel; gele stippen duiden op de rekrutering van oplosbaar GFP-gelabelde C-terminale disc one in aggregaten. Gelabeld recombinant disc one, tot expressie gebracht en gezuiverd uit E. coli, was ook celinvasief voor neuronen in vivo wanneer het multimere eiwit stereotactisch werd geïnjecteerd in de mediale prefrontale cortex van een rat. Z-stack imaging bevestigt de aanwezigheid van recombinant disc one-eiwit in rat corticale neuronen, gekleurd met een antilichaam tegen neuronale kernen.

We hebben zojuist twee methoden laten zien voor het genereren van disc one-aggregaten om celinvasie te bestuderen. Met gebruik van een van deze methoden kunnen we de cellulaire effecten van de opname van disc one-aggregaten onderzoeken zonder de potentieel verstorende variabelen van recombinante genexpressie door transfectie van vreemd DNA. Deze technieken kunnen worden toegepast om de biologische effecten van disc one-eiwitpathologie in vitro in cellen, en in vivo via intracerebrale inoculatie of andere toedieningswijzen in diermodellen te onderzoeken.

Wij zijn ervan overtuigd dat deze technieken uiteindelijk ook kunnen worden overgedragen naar andere eiwitaggregaten, mits het protocol licht wordt aangepast aan elk specifiek eiwit. Besteed bij het uitvoeren van deze procedure voldoende tijd aan een zorgvuldige analyse van de confocale microscopiebeelden.