Het analyseren en opbouwen nucleinezuurstructuren met 3DNA

Het algemene doel van deze procedure is om de 3D NA-programmasuite toegankelijk te maken voor laboratoriumwetenschappers en anderen, zodat zij de ruimtelijke organisatie van DNA en RNA kunnen onderzoeken met geavanceerde computationele tools. Dit wordt bereikt door eerst de software te downloaden van het 3D NA-forum en deze op een lokale computer te installeren. De tweede stap bestaat uit het analyseren van een representatieve DNA-structuur op het niveau van de constituerende basenpaarstappen.

Vervolgens wordt dezelfde DNA-structuur aangepast op het niveau van de basepaarstap, waarna deze opnieuw wordt opgebouwd met behulp van de nieuw gedefinieerde parameters voor de basepaarstap. De volgende stap is de analyse van een groot ensemble van verwante structuren. De laatste stap is de uitlijning van een set verwante DNA-structuren op een gemeenschappelijk referentiekader om globale distorties van de structuren te visualiseren.

Uiteindelijk worden de 3D NA-tools gebruikt om te onderzoeken hoe individuele basenpaarstappen, inclusief die welke gebonden zijn aan geneesmiddelen en eiwitten, bijdragen aan de algehele vouwing van DNA en om de locaties en richtingen van aanzienlijke globale vervormingen te identificeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat de software robuust is en breed toepasbaar is op een verscheidenheid aan verschillende structuren die nucleïnezuren bevatten. De methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de biochemie en biofysica, zoals hoe genomen in drie dimensies zijn georganiseerd en welk type vervorming DNA kan aannemen.

Om de installatie van het softwarepakket te starten, gaat u naar de website van three DA op xthreed.org en klikt u op de link naar het 3D NA-forum. Selecteer binnen het forum de link voor registratie en volg de instructies om een nieuw account aan te maken.

Zodra een gebruikersnaam en wachtwoord zijn aangemaakt, logt u in op het forum, selecteert u de downloadlink in de welkomstsectie en kiest u op de nieuwe pagina voor 3D NA download. Dubbelklik op het tar gz-bestand om een map genaamd X 3D NA dash V 2.1 aan te maken, waarin de 3D NA-software staat. Open de terminalapplicatie, die op een Macintosh doorgaans onder hulpprogramma's te vinden is, en ga naar de directory X 3D NA dash V 2.1.

Voer het installatiescript uit dat nodig is om 3D NA correct te laten functioneren. Alle in deze video gebruikte commando's zijn terug te vinden in het tekstprotocol. Kopieer vervolgens de twee regels exportinstellingen die op het scherm verschijnen.

Als de gebruiker de software in de applicatiemap heeft geplaatst, moeten de twee regels verschijnen zoals hier wordt getoond. Open de teksteditor in de applicatiemap. Selecteer onder het menu Formaat de optie Maak platte tekst.

Als er een BRC-bestand bestaat, open het bestand dan als tekst, bewerk het en plak de exportinstellingen aan het einde van het bestand. Als er geen bash RC-bestand bestaat, plak de exportinstellingen dan in een leeg bestand en sla dit op onder de bestandsnaam bash RC in de home-directory. Voer het onlangs opgeslagen Bash RC-bestand uit binnen het terminalprogramma om de nieuwe instellingen beschikbaar te maken.

Deze video demonstreert de analyse van een representatieve nucleïnezuurstructuur: het DNA gebonden aan het HBB-eiwit van de bacterie Borrelia bergdorfii. De eerste stap in de 3D NA-analyse is het maken van een bestand waarin alle gepaarde basen worden vermeld. Dit gebeurt door een commando in te typen om het programma Find para toe te passen op de atoomstructuur die is opgeslagen in het bestand 2NP2.pdb.

De volgende stap in de analyse is het bepalen van de geometrische parameters die de structuur karakteriseren. Het commando analyze gebruikt het basepaarbestand als input en maakt verschillende uitvoerbestanden aan die in de werkmap verschijnen. De geometrische waarden kunnen vervolgens worden berekend door analyze two MP two bps te typen.

De gegenereerde outputbestanden omvatten twee bestanden: mp two out, dat een overzicht bevat van de berekende parameters, en bpco step par, dat een lijst bevat van de starre-lichaamparameters. Naast de analyse van een nucleïnezuurstructuur biedt de software 3D NA de mogelijkheid om een structureel model te bouwen op basis van starre-lichaamparameters via het rebuild-commando, om zo een benaderd atomair model te creëren dat coördinaten bevat voor zowel de backbone- als de base-atomen. Typ het in de tekst vermelde commando. Dit commando instrueert 3D NA om een standaard B-DNA-backboneconformatie toe te passen bij de constructie van modellen vanuit starre-lichaamparameters.

Een dubbele helixmodel met de rigide lichaamsparameters gevonden in de H-B-B-D-N-A-structuur kan vervolgens worden gebouwd door het juiste commando in te typen. Het bpco step par-bestand kan worden bewerkt om een gewijzigde structuur te genereren. Hier worden de extreme roll-hoeken aangepast op de twee plaatsen met de grootste buiging.

De structuur wordt vervolgens opgebouwd met de gewijzigde set stapparameters als invoerbestand. De twee modellen kunnen worden bekeken met een standaard moleculaire viewer, in tegenstelling tot de analyse van een enkele structuur die een nucleïnezuur bevat. Dit deel van de video laat zien hoe een groot ensemble van structuren in een set bestanden moet worden geanalyseerd, beginnend met de namen MD underscore set one PDB en eindigend met een getal.

De eerste stap in de analyse is de identificatie van de gepaarde basen door het programma find pair uit te voeren zoals eerder beschreven; aangezien de gehele set structuren hetzelfde basenparingsschema shares, hoeft find pair hier slechts één keer te worden uitgevoerd op een representatief bestand, namelijk het bestand dat eindigt op 1001. Dit genereert de informatie over de basenparing en slaat deze op in het bestand MD at set one BPS PS. De volgende stap bepaalt de geometrische parameters van de gehele set structuren met behulp van het commando X 3D ncore ensemble.Analyze. Vervolgens kunnen de gewenste starre-lichaamparameters worden geëxtraheerd uit het overzichtsuitvoerbestand MD at set one out.

Dit wordt uitgevoerd met behulp van de Command X three DCO ensemble extract. De rolhoeken worden geëxtraheerd en er wordt een door komma's gescheiden tekstbestand van de rolhoeken aangemaakt. Dit bestand kan worden ingelezen in andere programma's voor verdere analyse en plotting.

De meest recente versie van 3D NA heeft een nieuwe functie waarmee een gebruiker naar meerdere structuren vanuit een gemeenschappelijk perspectief kan kijken. Het X three DCO ensemble reorient-commando superponeert een verzameling gerelateerde structuren op een gemeenschappelijk basenpaar of basenpaarstap, zoals in eerdere protocollen. De eerste stap is het berekenen van de basenparing van het DNA met het find pair-programma.

In dit geval is het invoerbestand twee KEK pdb-bestanden die de 10 structuren van de CIA coli bevatten, waarbij de O 3D NA-operator gebonden is aan het kopstuk van het LAC-repressoreiwit. Het commando X three DCO ensemble reorient zal de individuele modellen in een multi-modelstructuur uitlijnen op een gemeenschappelijk referentiekader. Dit commando vereist zowel het PDB-bestand als het basenparingbestand uit de vorige stap als invoer.

Ook de identiteit van de basenpaarstap waartegen alle structuren zijn uitgelijnd, is opgenomen in het commando. De W 3D NA webinterface bevat enkele populaire functies van het 3D NA softwarepakket. Dit deel van de video vestigt de aandacht op de mogelijkheid om met de webserver driedimensionale modellen van proteïnen-gedecoreerd DNA te construeren.

De eerste stap bij het bouwen van een met proteïnen gedecoreerd DNA-model is het bezoeken van de W 3D NA-website op W three d.rutgers.edu. Selecteer 'reconstruction' in het menu linksboven op de pagina om de online functies voor modelbouw te activeren. De volgende stap is het selecteren van de link 'bound protein DNA template' in het lichtgrijs gearceerde kader in het midden van de nieuwe pagina.

Deze selectie activeert een uitklapmenu, waarmee de gebruiker het aantal gebonden eiwitten kan specificeren. De selectie van het aantal gebonden eiwitten leidt naar een nieuwe specificatiepagina. De gebruiker kan vervolgens de gewenste sequentie typen of plakken.

In het tekstvak in het midden van de nieuwe pagina bevindt zich onder het tekstvak een vervolgkeuzemenu om de helixconformatie van de ongebonden DNA-regio's te selecteren. Onderaan de specificatiepagina staat een tekstvak om de bindingsposities en bestandsnamen van de gebonden eiwitten in te voeren. De bindingspositie specificeert de locatie van het centrum van het gebonden eiwitfragment op de DNA-sequentie.

Onderaan de specificatiepagina bevindt zich een selectievak waarmee de gebruiker een voorbeeld van het eiwitgebonden DNA kan genereren. In dit geval is dit vak aangevinkt en is er op de knop 'doorgaan' geklikt. Deze actie genereert een overzichtspagina waarop de geselecteerde parameters worden vermeld, evenals eventuele fouten die zijn ontstaan door de overlap van de geselecteerde bindingsplaatsen.

De gebruiker kan de terugknop selecteren als er wijzigingen moeten worden aangebracht, of de build-knop om verder te gaan. De volgende pagina toont een statisch beeld van het DNA-eiwitcomplex in de meest uitgerekte configuratie en maakt online interactieve visualisatie mogelijk via web. De gebruiker kan ook een bestand downloaden met de atomaire coördinaten.

De 3D NA-softwaretools worden routinematig gebruikt om nucleïnezuurstructuren te analyseren. De waarden van de starre-lichaamparameters onthullen vervormingen in de driedimensionale structuur, zoals de twee locaties van extreme DNA-buiging in de grote groeve met grote positieve roll-hoeken die zijn gevonden bij stap 13 en 22. In het kristalcomplex van DNA met het Borrelia Bergdorf, RHBB-eiwit.

De mogelijkheid van de software om structuren uit deze grootheden te reconstrueren, maakt het mogelijk om te bepalen hoe individuele basen en basepaarstappen bijdragen aan de algehele moleculaire vouwing. Zoals hier geïllustreerd, weerspiegelt de globale buiging van DNA geïnduceerd door HBB meer dan de twee extreme rolvervormingen die hierboven zijn vermeld. Het DNA blijft sterk gekromd wanneer het wordt gereconstrueerd met deze basepaarstappen in gestrekte vorm.

Dat is het moment waarop de twee grootste waarden van de rol op nul zijn gezet. De nieuwe functionaliteit in 3D NA om grote aantallen verwante structuren te onderzoeken, maakt het mogelijk om zowel sequentie- als tijdsafhankelijke patronen in de ruimtelijke arrangementen van gesimuleerde DNA- en RNA-moleculen te extraheren. Bijvoorbeeld, de gele kleurcodering van de rolhoeken tussen opeenvolgende baseparen in twee grote sets van gesimuleerde DNA-structuren onthult de preferentiële buiging van deze moleculen bij purine-basepaarstappen.

De hogere roll-waarden, in het rood weergegeven, die gedurende korte perioden aan de uiteinden van het DNA aanhouden, wijzen op lokale smelting en her-annealing van de dubbele helixstructuur. De variatiepatronen van andere starre-lichaamparameters, zoals de hoeken en afstanden tussen complementaire basen, kunnen helpen bij het ontcijferen van de precieze structurele vervormingen. De mogelijkheid van de 3D NA-software om gerelateerde moleculen in een gemeenschappelijk referentiekader te heroriënteren, onthult kenmerken van de algemene structuur die verborgen zijn in veel van de bestanden die in de Protein Data Bank zijn opgeslagen.

Bijvoorbeeld, de conventionele uitlijning van verwante structuren op basis van een root mean square fit van overeenkomstige atomen produceert een reeks vergelijkbare ruimtelijke trajecten die hier ongeveer over elkaar heen vallen, de 10 NMR-gebaseerde modellen van de Esia coli, O 3D NA operator gebonden aan de hoofdonderdelen van het LAC-repressoreiwit; de superpositie van dezelfde structuren op een gemeenschappelijk coördinatenstelsel op het vijf-prime terminale basenpaar van elke duplex onthult aanzienlijke vervormingen van de globale structuur, waarbij de moleculen in duidelijk verschillende richtingen buigen. De structurele variabiliteit kan van invloed zijn op de mate waarin het CIA coli LAC-repressoreiwit aan O drie bindt en een lus induceert tussen O drie en sequentieel distante operatoren in de LAC-operon. Zoals hier geïllustreerd, kan de nauwkeurige plaatsing van een architecturaal eiwit zoals HBB van Borrelia burgdorferi een dramatisch effect hebben op de algehele vouwing van DNA.

Wanneer twee kopieën van de bekende structuur met hoge resolutie gescheiden zijn door 43 basenparen, vormt een DNA-fragment van 81 basenparen een compacte, bijna cirkelvormige configuratie. Indien de twee eiwitten door vijf extra basenparen gescheiden zijn, volgt het DNA een open, meanderend pad. De zeer verschillende arrangementen van de met eiwitten versierde duplex laten zien hoe de spatiëring van architecturale eiwitten de cyclisatie of looping van DNA na de ontwikkeling kan beïnvloeden.

Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van de structurele biologie van nucleïnezuren om DNA-eiwitinteracties, RNA-vouwen en het ontwerp van nanodeeltjes te verkennen, om zo een beter begrip te krijgen van ontwikkelingsdefecten en ziekten zoals kanker en om nieuwe therapeutica te ontwikkelen.