Identificatie van Plasmodesmal lokalisatie sequenties in eiwitten In Planta
15 augustus 2017
Plant intercellulaire verbindingen, de plasmodesmata (Pd), spelen een centrale rol in plant fysiologie en plant-virus interacties. Kritische Pd vervoer zijn signalen dat rechtstreekse eiwitten aan Pd sorteren. Onze kennis over deze sequenties is echter nog in de kinderschoenen. Beschrijven we een strategie om te identificeren Pd lokalisatie signalen in Pd-gerichte eiwitten.
Het algemene doel van deze procedure is om het plasmodesmata-lokalisatiesignaal in doeleiwitten te identificeren. De methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen bij het bestuderen van intercellulaire verbindingen van planten door het identificeren van kritische gedachten in signalen die eiwitten naar de plasmodesmata leiden, wat op zijn beurt de cel-tot-cel-transport van grote moleculen vergemakkelijkt. Het grote voordeel van deze techniek is dat de procedure betrouwbaar is en gemakkelijk kan worden aangepast voor de ontdekking van plasmodesmata-lokalisatie signaalsequenties in de meeste plasmodesmata-doeleiwitten.
Videodemonstratie van deze methode is cruciaal omdat de stappen voor het planten, filteren en voorbereiding voor confocale observatie moeilijk te leren zijn via typische op print gebaseerde publicaties. Plant Nicotiana benthamiana zaden in natte grond en op een hoge dichtheid. Tijdens het groeien, houd ze in een gecontroleerde omgevingskamer bij 20 tot 25 graden Celsius en onder 16 uur licht per dag, die ongeveer 75 micromol fotonen per meter vierkant per seconde bevat.
Nadat de diameter van de u. fil een halve centimeter bereikt, verplaats de zaailingen voorzichtig naar grotere potten en zet hun groei voort in dezelfde kamer onder dezelfde omstandigheden. Houd de planten totdat ze binnen vier weken uitgroeien tot het stadium van vier tot acht bladeren.
Op dit punt zouden de grootste bladeren vier tot zes centimeter in diameter moeten zijn. Kies voor eenvoudige identificatie en analyse een expressiesysteem en markeer elk tot expressie gebracht eiwit fluorescent zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Bereid een pPZP-RCS2-gebaseerd plasmide voor zoals beschreven en voeg er een microgram van toe aan een 100 microliter cultuur van competente cellen van Agrobacterium tumefaciens.
Incubeer de cellen gedurende 30 minuten op ijs. Bevriest vervolgens de cellen gedurende een minuut in vloeibaar stikstof. Verwarm vervolgens de cellen gedurende 15 minuten op 28 graden Celsius en voeg vervolgens een milliliter LB-medium toe aan het competente cellenmengsel.
Na het toevoegen van het LB-medium, plaats de cellen gedurende twee uur terug op 28 graden Celsius. Draai vervolgens de cellen gedurende een minuut bij 3.000 keer G. Breng de celpellet weer op in 0,2 milliliter LB-medium en plateer ze op selectieve LB-agar platen met antibiotica.
Laat de cellen 48 uur groeien op de platen bij 28 graden Celsius totdat individuele kolonies zichtbaar zijn. Neem vervolgens verschillende individuele kolonies op en plateer ze op verse LB-agar platen en laat de cellen 48 uur groeien bij 28 graden Celsius. Neem vervolgens een kleine hoeveelheid bacteriën van elke plaat voor analyse en gebruik Colony PCR om de aanwezigheid van de specifieke binaire constructies van belang te bevestigen.
Voeg elke agrobacterium kolonie met het construct van belang toe aan vijf milliliter LB-medium aangevuld met de juiste antibiotica. Laat de cellen een nacht groeien bij 28 graden Celsius. Centrifugeer vervolgens de cellen bij 3.000 keer G. Breng de pellet terug op tot een OD600 van 0,5 in agroinfiltratiebuffer.
Incubeer de suspensie gedurende twee uur op kamertemperatuur en laad vervolgens het inoculum in een plastic spuit van één milliliter. Houd een volledig volgroeide N. Benthamiana blad met een behandschoende vinger op de adaxiale kant vast, druk de spuitnaald tegen de onderste epidermis van het blad. Breng vervolgens langzaam de agrobacterium in infiltratiemedium binnen door het medium te injecteren.
Houd de geïnfiltreerde plant totdat deze moet worden waargenomen. Gebruik een mes om elk blad 24 tot 48 uur na infiltratie in fragmenten tussen de nerven te snijden. Plaats de bladsneden op de objectslide met de abaxiale bladoppervlakte naar boven.
Plaats vervolgens een druppel water op de bladsnede en bedek deze met het dekglas. Immobiliseer het dekglas met kleine stukjes tape aan elke kant. Breng een slide onder een laser-scanning confocale microscoop en gebruik een 10X subjectief objectief om cellen met het beste signaal te identificeren.
Gebruik vervolgens een 63X subjectief objectief om beelden op te nemen voor meer gedetailleerde observaties. Gebruik daarnaast de juiste fluorescentie om de tot expressie gebrachte fluorescente eiwitten te exciteren. Behoud alle instellingen die worden gebruikt voor beeldacquisitie om consistentie tussen experimenten te behouden.
Onderzoek gemiddeld 100 tot 120 cellen voor elke experimentele conditie. Diagnosticeer de lokalisatie van de geteste eiwitten met behulp van de confocale microscoopbeelden. Deze afbeeldingen illustreren de karakteristieke perifere gepuncteerde plasmodesmata-lokalisatiepatronen die worden waargenomen voor het volledige TMV-bewegingseiwit gefuseerd met het vrachtmolecuul CFP, en voor het geïdentificeerde plasmodesmata-lokalisatiesignaal gefuseerd met CFP, evenals voor het co-geëxpresseerde plasmodesmata-lokalisatie-eiwit, PDCB1 gefuseerd met DsRed.
Onder controleomstandigheden lijkt de plasmodesmata-targetting van het volledige TMV-bewegingseiwit gefuseerd met CFP en het lokalisatie-signaal in het TMV-bewegingseiwit gefuseerd met CFP, zoals hier getoond met subcellulaire lokalisatie van CFP en nucleocytoplasmatische lokalisatie van de marker DsRed2. Wanneer het vierde aminozuur, valine, wordt gemutateerd naar een alanine, gaat de plasmodesmata-targetting door zowel het volledige TMV-bewegingseiwit als het geïdentificeerde lokalisatie-signaal in TMV-bewegingseiwit verloren. Dit geeft aan dat deze rest belangrijk is voor de structuur of functie van het plasmodesmata-lokalisatiesignaal.
Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in 50 uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de planten in zeer gezonde conditie te houden en de planten zich in het juiste bladstadium te bevinden. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van, niet alleen hoe u plasmodesmata-lokalisatie-eiwitsignaal kunt identificeren, maar ook hoe u andere bepaalde signalen in planteneiwitten kunt identificeren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op het identificeren van plasmodesmata-lokalisatiesignalen in doelproteïnen, die essentieel zijn voor het begrijpen van intercellulaire verbindingen in planten. De beschreven methode is betrouwbaar en aanpasbaar voor het ontdekken van deze signalen in diverse plasmodesmata-gerichte proteïnen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Plantenfysiologie
- Celbiologie
- Interacties tussen planten en virussen
Achtergrond
- Plasmodesmata (Pd) zijn essentieel voor het transport van cel naar cel in planten.
- Sorteersignalen sturen eiwitten naar de Pd, wat het transport faciliteert.
- De huidige kennis over deze sequenties is beperkt.
- Inzicht in deze signalen kan onze kennis van de plantenfysiologie vergroten.
Doel van de studie
- Om plasmodesmata-lokalisatiesignalen in doelproteïnen te identificeren.
- Om het begrip van intercellulaire verbindingen in planten te verbeteren.
- Om de studie van proteïnetransportmechanismen te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Het planten van Nicotiana benthamiana-zaden onder gecontroleerde omstandigheden.
- Het handhaven van optimale groeiomstandigheden (20-25掳C, 16 uur licht).
- Het gebruik van confocale observatietechnieken voor analyse.
- Het bieden van een videodemonstratie voor complexe stappen.
Belangrijkste resultaten
- De methode identificeert effectief lokalisatiesignalen in proteïnen.
- De methode is aanpasbaar voor diverse plasmodesmata-gerichte proteïnen.
- Videobronnen verbeteren het begrip van de procedure.
- Betrouwbare resultaten dragen bij aan het vakgebied van de plantbiologie.
Conclusies
- De studie biedt een waardevolle techniek voor het identificeren van Pd-lokalisatiesignalen.
- Het begrijpen van deze signalen kan leiden tot vooruitgang in het onderzoek naar plantenfysiologie.
- De betrouwbaarheid van de methode maakt het een nuttig instrument voor onderzoekers.
Veelgestelde Vragen
Industriële Relevantie voor Management
Het identificeren van lokalisatiesignalen voor plasmodesmata maakt mechanische risicoreductie mogelijk voor plantgebaseerde expressiesystemen die worden gebruikt bij de productie van recombinante eiwitten. Deze benadering ondersteunt de validatie van doelwitten door subcellular trafficking-routes te verduidelijken die cruciaal zijn voor de productie van biologische geneesmiddelen in plantgastheren. De methode verhoogt het voorspellende vertrouwen in de eiwitlokalisatie, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen voor therapeutische kandidaten afgeleid van planten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt eiwitsorteringsmechanismen om functionele targetingsignalen te valideren die noodzakelijk zijn voor transport via plasmodesmata.
- Operationele waarde: Biedt een betrouwbare, aanpasbare strategie om noodzakelijke en voldoende lokalisatiesignalen direct in levende plantencellen te identificeren.
- Voorspellende waarde: Maakt functionele bevestiging van targetingmotieven mogelijk via mutagenese, zoals een valine-naar-alanine substitutie die de lokalisatie verstoort.
Screening & assay-ontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Maakt gebruik van fluorescentiemarkering en confocale microscopie om kwantitatieve, reproduceerbare lokalisatiegegevens te genereren.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt het screenen van meerdere eiwitvarianten via Agrobacterium-gemedieerde transiënte expressie in Nicotiana benthamiana.
- Herbruikbaarheid van het platform: De workflow kan worden toegepast op diverse plasmodesmata-gerichte eiwitten naast virale bewegingseiwitten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt de ontdekking van lokalisatiesignalen met de daaropvolgende evaluatie van eiwitmobiliteit en de efficiëntie van intercellulair transport.
- Ziekterellevant systeem: Maakt gebruik van een gevestigd plantmodel dat compatibel is met transiënte expressie voor snelle validatie van signalen.
- Mechanische risicoreductie: Vermindert onzekerheid over eiwittransport door het definiëren van cis-werkende elementen die vereist zijn voor targeting naar plasmodesmata.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen vroege ontdekkingsworkflows waarbij subcellulaire lokalisatie informatie verschaft voor proteïne-engineering en het ontwerp van constructen voor plantgebaseerde expressieplatforms.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt het testen van hypothesen over targetingsequenties via directe visualisatie van eiwitlokalisatie in planta.
- Screening: Maakt beoordeling van signaalfunctionaliteit mogelijk door colokalisatie met plasmodesmata-markers zoals PDCB1-DsRed.
- Analytiek: Genereert op beeldvorming gebaseerde kwantitatieve gegevens over subcellulaire distributiepatronen onder gecontroleerde expressiecondities.
- Translationeel onderzoek: Biedt mechanistisch inzicht in intercellulair transport, relevant voor het optimaliseren van eiwitopbrengst en mobiliteit bij bioproductie in planten.
- Bedrijfsmatig hergebruik: Vestigt een gestandaardiseerde pipeline voor de ontdekking van lokalisatiesignalen die toepasbaar is op meerdere eiwitdoelen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van het doelwit door de minimale functionele sequenties te definiëren die vereist zijn voor lokalisatie in de plasmodesmata.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar, videogestuurd protocol dat de variabiliteit in lokalisatie-assays vermindert.
- Strategische waarde: Informeert de optimalisatie van constructen om het intracellulaire transport in plantexpressiesystemen te verbeteren.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van eiwitkandidaten op basis van gevalideerde subcellulaire targeting.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in transiënte expressie in planten, confocale microscopie en fluorescent eiwitlabeling.
- Afhankelijk van infrastructuur voor Agrobacterium-infiltratie en gecontroleerde plantengroeikamers.
- Vereist standaardisatie van beeldinstellingen en analysecriteria over verschillende experimentele condities.
- Aanpassing aan verschillende plantensoorten kan optimalisatie van infiltratie- en groeiparameters vereisen.
- Beperkt tot eiwitten die stabiel kunnen worden tot expressie gebracht en fluorescent gelabeld in planta zonder de oorspronkelijke functie te verstoren.
