De MODS methode voor de diagnose van tuberculose en multidrug-resistente tuberculose

Van elke drie mensen ter wereld is er één geïnfecteerd met tuberculose. Het diagnosticeren van actieve tuberculose voorkomt nieuwe infecties, aangezien patiënten met actieve tuberculose jaarlijks tussen de 10 en 15 andere mensen zullen infecteren totdat zij behandeld worden of overlijden. MODS is een acroniem dat we gebruiken om te voorkomen dat we telkens microscopische observatie en gevoeligheidsmeting voor geneesmiddelen moeten noemen; de reden voor deze benaming wordt duidelijk naarmate de methodologie wordt uitgelegd.

In deze korte video schetsen we de mods-methodologie voor de snelle en goedkope diagnostiek van tuberculose en multi-drug resistente tuberculose. De video zet de methodologie stap voor stap uiteen. We bespreken de biosafety-implicaties van het werken met vloeibare culturen en we leggen ook enkele belangrijke aspecten van kwaliteitsbewaking toe die vereist zijn voor het gebruik van deze methodologie.

De mods-assay werd ontwikkeld aan de Kayana Universiteit in Lima, Peru, in het laboratorium van Bob Gilman. Dit volgde op waarnemingen die aanvankelijk waren gedaan door loose cavi. LOOSE probeerde snelle methoden te identificeren voor het detecteren van mycobacterium tuberculosis in culturen met behulp van colorimetrische indicatoren.

Ze merkte echter op dat de observatie van deze culturen onder de microscoop de aanwezigheid van microbacteriële groei onthulde enkele dagen voordat de colorimetrische indicatoren van kleur veranderden, en op basis van die observatie werd de assay van MOD ontwikkeld. De assay van MOD is ontwikkeld in een omgeving met beperkte middelen en is gericht op omgevingen met beperkte middelen, waardoor de kosten minder dan 3 per test bedragen voor de detectie van TB op basis van vloeibare cultuur en de detectie van multiresistentie. Dit is uiterst aantrekkelijk en brengt voor het eerst een dergelijke diagnostische capaciteit naar plaatsen waar de middelen beperkt zijn.

De MODS-assay is gebaseerd op drie centrale principes. Het eerste is dat Mycobacterium tuberculosis in vloeibare media veel sneller groeit dan in vaste media. Dit is een feit dat al vele jaren bekend is.

Ten tweede is dat wanneer we deze vloeibare media onder de microscoop observeren, we de groei van M. tuberculosis veel sneller kunnen detecteren dan wanneer we wachten op de macroscopische verschijning van kolonies op vaste media. Bovendien is die groei geheel kenmerkend, waardoor we M. tuberculosis in vloeibare media kunnen onderscheiden van bacteriële of schimmelcontaminatie, of van de groei van atypische niet-tuberculose mycobacteriën die mogelijk aanwezig zijn. Ten slotte, en dit is wellicht het meest opwindende aspect van de MGIT-assay, is dat we geneesmiddelen zoals rifampicine kunnen toevoegen en zo direct vanuit sputum op multiresistentie kunnen testen.

Door deze geneesmiddelen aan het begin van de assay te gebruiken, kunnen we zowel tuberculose detecteren als gelijktijdig vaststellen of het isolaat resistent is tegen deze twee middelen. Dit maakt het overzetten in een subcultuur en het uitvoeren van een indirecte gevoeligheidstest voor geneesmiddelen overbodig. We zullen nu de benodigde apparatuur voor de mods-assay beschrijven.

Een koelkast is nodig voor het bewaren van de bereide media. Een balans is vereist om het medium en Rifampicine af te wegen. Een vortexmixer is nodig voor het mengen van het sputum.

Voor de contaminatie-oplossing is een centrifuge vereist om het gedecontamineerde sputummonster te concentreren, waarbij een versnelling van 3000 G bereikt moet kunnen worden. De centrifuge hoeft niet gekoeld te zijn, maar het is absoluut essentieel dat deze biologisch veilig is. Voor werk met mycobacteriën is het vereist dat de centrifugebakken kunnen worden afgesloten met vergrendelbare deksels. Er is een incubator nodig die 37 °C kan bereiken en op 37 °C kan houden.

Dit hoeft niet CO2-verrijkt te zijn. Een omgekeerde microscoop is vereist om de mods-platen af te lezen, en deze moet voorzien zijn van objectieven van 4x en 10x; een autoclaaf is nodig om media te steriliseren en voor de verwijdering van microbacteriële culturen. Waste micros zijn vereist voor het aliquoteren in media, en een biologische veiligheidskast klasse II is vereist voor procedures waarbij sputummonsters worden gemanipuleerd en platen worden geinoculeerd.

De reagentia die nodig zijn voor het uitvoeren van de mods-assay zijn als volgt: Middlebrook 7H9-medium, caséïne en glycerol, Panta, wat het antibioticasupplement is, en OADC, het nutritionele supplement. De voorraadoplossingen van de antibiotica zijn isoniazide en rifampicine, dimethylsulfoxide (DMSO) voor de bereiding van rifampicine, natriumhydroxide, natriumcitraat en N-acetyl-L-cysteïne voor de decontamination van sputum, dinatriumfosfaat en monokaliumfosfaat voor de bereiding van de fosfaatbuffer, 10% natriumhypochloriet voor de verwijdering van besmet afval en desinfectiemiddel voor het reinigen van werkoppervlakken. De volgende kunststoffen en verbruiksartikelen zijn ook vereist: steriele glazen buizen, 0,2 µm filters voor waterige oplosmiddelen en 0,2 µm filters voor organische oplosmiddelen, microcentrifugebuisjes, 15 ml centrifugebuizen, steriele 50 ml en 10 ml serologische pipetten, steriele micropipetpunten, 24-wells weefselkweekplaten en afsluitbare Ziploc-type plastic zakken waarin de 24-wells platen worden geplaatst nadat het sputummonster in het medium is geïnoculeerd.

Er zijn vier groepen stamoplossingen die vooraf kunnen worden bereid. De fosfaatbuffersolution bestaat uit een combinatie van natriumfosfaat, diba en kaliumfosfaat-monobasische oplossingen, ingesteld op een pH van 6,8 plus of minus 0,2. Deze oplossing wordt gedurende 15 minuten geautoclaveerd bij 121 tot 124 °C om te steriliseren, waarna een aliquot op nutriëntenagar wordt gekweekt om de steriliteit te bevestigen.

Dit kan gedurende maximaal één maand worden bewaard in de koelkast bij twee tot acht graden Celsius. Elk sputummonster vereist 10 milliliters fosfaatbuffersolution. De voorraadoplossing voor decontaminatie van sputum is een combinatie van natriumhydroxide en natriumcitraat.

Deze oplossingen worden in gelijke volumes gecombineerd en 15 minuten geautoclaveerd bij 121 tot 124 °C en kunnen ook tot één maand worden bewaard in de koelkast bij 2 tot 8 °C. Voor elk sputummonster is 2 mL van deze oplossing nodig. Het basisculturemedium bestaat uit Middlebrook 7H9 met caseïne en glycerol.

Het seven H nine-poeder wordt opgelost in steriel gedestilleerd water dat glycerol en caseïne bevat en gemengd onder constante agitatie tot het volledig is opgelost. Dit medium wordt geautoclaveerd bij 121 tot 124 °C gedurende 15 minuten en wordt na afkoeling verdeeld in aliquots van 4,5 mL in steriele glazen buisjes van 16 bij 100 mm. Het medium wordt 48 uur lang geïncubeerd bij 37 °C om de steriliteit te verifiëren, wat wordt aangetoond door een gebrek aan troebeling na deze periode; het kan vervolgens tot een maand worden bewaard bij 2 tot 8 °C met de dop stevig gesloten.

Voor elk sputummonster is één buis nodig die 4,5 milliliter van deze cultuur bevat. Voorraadoplossingen van het medium met antibiotica worden als volgt bereid: los volledig op in steriel gedestilleerd water en filter met een spuitfilter van 0,2 micrometer voor waterige oplosmiddelen. Aliquots van 20 microliter kunnen vervolgens worden bewaard in steriele microcentrifugebuisjes bij minus 20 graden Celsius voor maximaal zes maanden; elke aliquot van 20 microliter is voldoende voor maximaal honderd monsters.

Rifampine-stamloplossingen van 8 mg/ml worden bereid door rifampicine op te lossen in DMSO en steriel gedestilleerd water. Dit mengsel wordt gefilterd met een 0,2 µm spuitfilter voor organische oplosmiddelen en de oplossing kan worden bewaard in aliquots van 20 µL in steriele microcentrifugebuisjes bij -20 °C gedurende maximaal zes maanden; elke aliquot van 20 µL is voldoende voor maximaal 100 monsters. We komen nu bij het gedeelte van de methodologie zelf en de drie stappen die u op de dag van de procedure moet uitvoeren.

Hierbij worden de stamoplossingen omgezet in werkoplossingen. Eerst bereiden we de descontaminatielossing, daarna de mediumoplossing. En tot slot de werkoplossingen van de geneesmiddelen isen en Rifampine.

De decontaminationmethode die wordt gebruikt voor de mods-methodologie is de gestandaardiseerde deconaminatiemethodologie met natriumhydroxide en nalk. Nalk is een mucolyticum dat helpt bij het verteren van het sputum, waardoor het natriumhydroxide de decontamination kan uitvoeren. Hiervoor hebben we onze natriumhydroxide-natriumcitraat-stoomoplossing nodig, waarbij 0,1 gram NA wordt toegevoegd aan 20 ml van die oplossing.

Elke oplossing die niet op de dag van bereiding wordt gebruikt, moet worden weggegooid. De uiteindelijke bereiding van het kweekmedium moet eveneens alleen op de dag van gebruik plaatsvinden. Bewaard seven H nine-medium wordt gecombineerd met OADC en panta: in elke buis worden 4.5 milliliters van het medium gecombineerd met 0.5 milliliters OADC en 0.1 milliliters Panta.

Dit is voldoende voor één monster. Werkoplossingen van elk geneesmiddel worden op de dag van gebruik bereid en alle ongebruikte oplossingen moeten worden weggegooid omdat de activiteit van bewaarde aliquots niet kan worden gegarandeerd; deze worden in 24-wells tissue culture platen seriële verdunningsreeksen gemaakt met media seven H nine oh A DC, zodanig dat de uiteindelijke concentratie in de well die wordt bereikt nadat het sputummonster met media is toegevoegd, 0,4 µg/ml voor foric acid en 1 µg/ml voor Rifampine is.

We gaan nu over naar de decomcontaminatieprocedure; 2 ml sputummonster wordt in een conische Falcon-buis geplaatst, waarna 2 ml van onze natriumhydroxide-oplossing voor decomcontaminatie wordt toegevoegd. De dop wordt teruggeplaatst en stevig aangedraaid, waarna de suspensie wordt gevortexed en 15 minuten blijft staan, gedurende welke tijd de decomcontaminatieprocedure plaatsvindt. Na deze tijd worden 14 ml fosfaatbuffersolution toegevoegd.

Het deksel wordt teruggeplaatst en stevig aangekruist, en de buis wordt in de centrifuge geplaatst. Na 50 minuten bij 3000 G wordt het S-supernatant weggegoten en het overgebleven pellet is de sample die we willen uitplaten met behulp van de 5,1 milliliter buizen van zeven H negen OEDC panter. Ons pellet wordt geresuspendeerd tot een volume van ongeveer twee milliliter. De helft van deze geresuspendeerde sample wordt als back-up bewaard in een microcentrifugebuis.

Dit is vervolgens beschikbaar voor het geval onze cultuur besmet raakt en we het monster opnieuw moeten uitplaten. De andere milliliter wordt toegevoegd aan de resterende zeven H negen oh a DC panter in onze glazen buis, en dit is ons monster dat klaar is om te worden uitgeplaatst. 900 µL van deze suspensie van medium en monster wordt in elk van vier putjes in een kolom van een 24-well plaat geplaatst.

De overige putjes van de 24-wellsplaat worden gevuld met opeenvolgende monsters, zodanig dat vijf monsters een 24-wellsplaat vullen, één voor elk van de vijf kolommen, waarbij de zesde kolom zonder monster blijft. De zesde kolom dient als negatieve controle; in deze kolom worden alle bestanddelen van het medium geplaatst zonder sputummonster. Elke vorm van groei in deze kolom wijst duidelijk op een probleem met kruiscontaminatie, waardoor de gehele plaat moet worden weggegooid.

Elke plaat die we gebruiken vereist een kolom met negatieve controles. We hebben nu onze plaat met alle monsters en medium. We moeten onze antibioticasuspensies in een aparte plaat toevoegen.

We hebben onze verdunningen van Rifampine en Isid klaargezet zoals eerder beschreven, en met een vierkanaals multichannelpipet nemen we 100 µL uit elk van deze wells. Vervolgens dispenseren we 100 µL 7H9 OADC in elk van de twee controlewells, en 100 µL Rifampine en 100 µL Isid in elk van de twee wells die het medicijn bevatten. Zodra de plaat is voltooid, wordt het deksel teruggeplaatst en wordt deze in een Ziploc-zak geplaatst. Vanaf dit punt wordt de zak niet meer geopend, waardoor culturen die groeien in vloeibaar medium nooit de gelegenheid krijgen om de zak te verlaten.

Alle verdere aflezingen van de plaat worden in de zak uitgevoerd, en de zak wordt geplaatst in een autoclaafzak en aan het einde van de kweek weggegooid. Op deze manier vermijden we manipulatie van sterk geconcentreerde suspensies van mycobacteriën. We zullen nu nog enkele woorden zeggen over de kwaliteitscontrole.

Er zijn ingebouwde kwaliteitscontroles in de mods-methodiek, die essentieel zijn voor het correcte gebruik van de assay. Ten eerste zijn er negatieve controles die op elke plaat worden uitgevoerd. Deze zijn eerder genoemd, maar samengevat hebben we een kolom die alle mediabestanddelen bevat zonder de aanwezigheid van een sputummonster, naast vijf andere sputummonsters op een plaat; de wells in deze kolom moeten op dezelfde wijze worden onderzocht als alle andere wells, en de aanwezigheid van enige groei in deze wells duidt op kruiscontaminatie, waardoor geen van de resultaten op de plaat betrouwbaar is.

De plaat moet daarom worden weggegooid en alle monsters moeten opnieuw worden uitgeplaat. Daarnaast zijn er interne controles die dienen als positieve controles. Deze worden op een aparte plaat uitgevoerd; deze plaat wordt aan het einde van de dag voorbereid, nadat alle andere monsterplaten zijn voorbereid, om het risico op kruiscontaminatie binnen het laboratorium te minimaliseren.

Op deze aparte plaat brengen we één volledig gevoelige stam van mycobacterium tuberculosis en een stam aan die resistent is tegen isid en rifampicine. Indien er zorgen zijn over het gebruik van een multi-drugresistente stam op een plaat, kan een rifampicine-monoresistente stam samen met een is-monoresistente stam worden gebruikt in plaats van deze twee gevoelige en MDR-stammen. Het doel van deze stammen is om niet alleen aan te tonen dat het medium groei ondersteunt — alle positieve controles moeten daarom groei vertonen in de drug-vrije putjes — maar ook dat onze drugconcentraties correct zijn; de gevoelige positieve controles mogen dus niet groeien in de aanwezigheid van is en rifampicine, terwijl de resistente positieve controles uiteraard wel moeten groeien bij de concentraties rifampicine en is die op de plaat aanwezig zijn.

Oké, we gaan nu over naar het aflezen van de platen. Als we de dag dat de monsters worden uitgeplaat als dag nul beschouwen, begint het aflezen van de platen op dag vijf. Vóór die tijd wordt mycobacteriële groei zeer zelden waargenomen.

Platen worden onderzocht met een omgekeerde lichtmicroscoop. Dit betekent dat de platen van onderen naar boven worden bekeken, waardoor de cords zeer duidelijk zichtbaar zijn; het visualiseren van de culturen van bovenaf wordt belemmerd door condens op het deksel van de platen, en ook omdat de brandpuntsafstand van een standaardmicroscoop niet adequaat is. Microscopisch onderzoek wordt doorgaans uitgevoerd met het 10 x objectief; positieve culturen worden beschouwd als culturen waarin ten minste twee colony forming units aanwezig zijn in beide drug-vrije wells.

De aanwezigheid van contaminatie is gemakkelijk te herkennen omdat het medium troebel wordt en er tegen dag vijf over het algemeen overgroei in het grootste deel van het putje optreedt. In tegenstelling hiermee leidt de groei van mycobacteriën niet tot troebeling van het putje; de initiële groei van mycobacteriën vormt kleine komma-achtige structuren, die gestaag vorderen tot de vorming van karakteristieke koorden of kluwens. Binnen twee weken zal een sterk positieve groei conglomeraten van mycobacteriën hebben gevormd, waarbij de koorden alleen aan de uiteinden echt zichtbaar zijn.

De overgrote meerderheid van de culturen die positief worden, zijn dat uiterlijk op dag 14; daarom raden wij dagelijkse aflezingen aan van dag vijf tot dag 14, en daarna om de twee of drie dagen, afhankelijk van de werklast in het laboratorium. Op de dag dat een cultuur duidelijk positief is in de twee drugvrije wells, moeten de drugbevattende wells worden afgelezen. Elke groei in de aanwezigheid van een van beide middelen duidt op resistentie tegen dat middel. Het is zeer belangrijk om op te merken dat wanneer de aflezing van de drugbevattende wells meer dan een week na het vaststellen van een positieve cultuur in de drugvrije wells plaatsvindt, dit mogelijk geen resistentie vertegenwoordigt, aangezien incidentele doorbraakgroei kan worden waargenomen.

Aflezingen kunnen op dag 21 worden stopgezet als een kweek negatief is, aangezien positieve kweken na deze periode nooit worden aangetroffen bij patiënten die geen therapie ontvangen. Na voltooiing van 21 dagen incubatie mogen de kweken worden weggegooid. De kweken blijven in hun Ziploc-zakken, worden in autoclaafzakken geplaatst en geautoclaveerd bij 121 tot 124 °C gedurende 45 tot 60 minuten, waarna ze veilig kunnen worden afgevoerd. Ik wil nu nog enkele woorden zeggen over biosafety en de mods-assay, aangezien we mods niet alleen in Peru, maar ook in settings in Afrika en Azië hebben uitgerold.

Er komt regelmatig een vraag naar voren over de veiligheid en de biosafety bij het gebruik van microbacteriële culturen in vloeibare media. Dit is een begrijpelijke vrees, aangezien vloeistoffen overduidelijk kunnen morsen terwijl vaste media dat risico niet kennen, en er bovendien een risico is op aerosolisatie wanneer we werken met suspensies van mycobacteriën. Juist vanwege deze redenen geloven wij dat de mod-methodologie een veiligere methodologie is dan elke methodologie die indirecte gevoeligheidstesten voor geneesmiddelen vereist.

De reden hiervoor is dat er voor indirecte gevoeligheidstests een suspensie van een bekende concentratie microbacteria wordt bereid. Dit houdt derhalve de manipulatie in van sterk geconcentreerde oplossingen van microbacteria, met alle bijbehorende risico's op morsen en aerosolisatie. In tegenstelling hiermee houdt de mods-methodologie, zoals u nu heeft gezien, simpelweg de inoculatie van een sputummonster in onze plaat in, waarna de plaat in een plastic zak wordt verzegeld.

Deze zak wordt nooit meer geopend, waardoor we niet met deze sterk geconcentreerde suspensies hoeven om te gaan. Dit betekent niet dat we geloven dat de mod-methodologie volledig veilig is; het hanteren van mycobacteriën brengt altijd een risico met zich mee. Gegevens uit Korea die in 2006 werden gepubliceerd, leken echter ons standpunt te bevestigen dat mods niet gevaarlijker is dan het uitplaten van elke andere cultuur.

Dit was een studie die werd uitgevoerd bij laboratoriummedewerkers, waaruit bleek dat de beroepsrisico's voor laboratoriummedewerkers die culturen uitplaatsten en geen verantwoordelijkheid hadden voor drugsusceptibiliteitstesten niet groter waren dan die voor personen die sputumuitstrijkmicroscopie uitvoeren. In contrast hiermee hebben zij die suspensies van mycobacteriën hanteren en drugsusceptibiliteitstesten uitvoeren veel hogere beroepsrisico's voor tuberculose. Het is overduidelijk van cruciaal belang dat al het laboratoriumpersoneel zo goed mogelijk wordt beschermd, en wij bevelen daarom sterk aan dat geen van deze procedures wordt uitgevoerd zonder passende persoonlijke ademhalingsbescherming, waarmee we N95-standaardmaskers bedoelen.

Daarnaast is een biologische veiligheidskabinet of zuurkast van klasse twee vereist, waarbij alle uitlaatlucht via HEPA-filters wordt gefilterd. Ten slotte is een simpel mechanisme dat zeer belangrijk is om turbulentie van de luchtstroom in een laboratorium te voorkomen, een slot op de laboratoriumdeur om het in- en uitgaan van personeel te stoppen terwijl monsters worden verwerkt. Dit vermindert het risico op transmissie binnen het laboratorium. Ik hoop dat dit u een goed overzicht heeft gegeven van wat de mods-methodologie inhoudt en hoe nuttig deze kan zijn in omgevingen waar middelen beperkt zijn, maar waar hoogwaardige TB- en MDR-TB-diagnostiek dringend vereist zijn.

Voor meer informatie kunt u onze website bezoeken, mods peru. org, waar u onze gedetailleerde standaardprocedures (SOP's) en de gebruikershandleiding voor mods vindt. Naast de SOP's voor de verwerking van extrapulmonale monsters beschikken we ook over een fotobibliotheek van mycobacterium tuberculosis, andere mycobacteriën en bacteriële en schimmelcontaminatie, en u vindt daar tevens onze strategie voor kwaliteitsborging en de procedure die wij aanbevelen voor de accreditatie van laboratoria om met mods te beginnen.

Tot slot is er een overzicht met veelgestelde vragen, en we verwelkomen alle feedback van gebruikers die momenteel mods gebruiken, aangezien dit een iteratieve methodologie is. Zoals we eerder hebben uitgelegd, is dit een niet-gepatenteerde test en we zijn altijd geïnteresseerd in verbeteringen die andere laboratoria hebben weten te realiseren.