Oczyszczanie i wizualizacja kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy A

Procedura rozpoczyna się od usunięcia zanieczyszczeń z roztworu wirusa grypy poprzez wirowanie. Następnie błonę wirusową niszczy się za pomocą detergentu, a uwolnione vRNPs rozdziela się w gradiencie glicerolu.

Frakcje odwirowane z gradientu są zbierane, a następnie analizowana jest alikwota każdej z nich. Żele w żelu SDS-PAGE barwi się błękitem Kumasi, aby wyznaczyć frakcje szczytowe zawierające V nps. Frakcje zawierające V NPS są następnie zagęszczane poprzez wirowanie, a oczyszczone VRP przenosi się na miedzianą siatkę do TEM, którą następnie barwi się negatywnie w celu wizualizacji VRP za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Cześć, nazywam się WinCo Wu i pracuję w laboratorium dr Nellie Pane w Katedrze Zoologii na Uniwersytecie Kolumbijskim w Brytyjskiej Kolumbii.

Nazywam się Lindsay Weaver, wcześniej związana z laboratorium Pane. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę oczyszczania kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu badania importu jądrowego wirusa grypy typu A w komórkach hodowli tkankowych.

Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć eksperyment, należy wlać 750 µL buforu MNT do jednej probówki wirówkowej Beckman z poliwęglanu o wymiarach 11 mm na 34 mm. Następnie do probówki należy dodać 500 µL roztworu wirusa grypy typu A o stężeniu 2 mg/mL i kilka razy pipetować zawartość w górę i w dół, aby wymieszać wirusa z buforem MNT.

Po wymieszaniu umieść probówkę w rotorze TLA one 20.2 i wiruj w wirówce Beckman Optima max E przez 10 minut przy 109 000 ×g w temperaturze 4 °C. Po zakończeniu wirowania usuń supernatant, a następnie zawieś osad w 500 µL buforu do rozbicia. Intensywnie wymieszaj zawiesinę na wirówce typu vortex, a następnie inkubuj przy 31 °C przez 20 minut w mieszalniku Eppendorf ThermoMixer.

Po zakończeniu wstrząsania należy przystąpić do sedymentacyjnej wirowania w gradiencie glicerolu. Aby przygotować gradient glicerolu, należy wprowadzić do probówki wirówki Beckman UltraClear 13 mm x 51 mm następujące objętości glicerolu: 1 ml 70% obj./obj. GLYCEROL, 0,75 ml 50% glicerolu, 0,375 ml 40% glicerolu oraz 1,8 ml 33% glicerolu. Roztwory glicerolu przygotowuje się poprzez mieszanie czystego glicerolu z buforem NM.

Należy również przygotować probówkę równoważącą zawierającą glicerol i bufor. Następnie ponownie wymieszać próbkę z rozbitymi wirusami w wiertaku i nanieść ją na gradient glicerolowy. Probówkę należy umieścić w rotorze z ruchomymi koszyczkami Beckman MLS 50 i wirować gradient przez trzy godziny i 45 minut przy 217 000 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po zakończeniu wirowania ręcznie pobierz aliquoty gradientu o objętości 250 µL, zaczynając od górnej części probówki. Przechowuj frakcje w lodzie lub w temperaturze 4 °C. Po zebraniu frakcji można przystąpić do ich analizy za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS.

Aby rozpocząć analizę SDS-PAGE, przenieś 20 µL z każdej frakcji do nowej probówki. Następnie dodaj 5 µL 5x buforu do próbek SDS-PAGE i podgrzewaj próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut. Po podgrzaniu krótko odwiruj próbki i nałóż je na 10% żel poliakrylamidowy, umieszczając markery masy cząsteczkowej w jednym z dołków. Następnie przeprowadź elektroforezę próbek w żelu, aż barwnik ładujący bromofenolowy dotrze do dolnej krawędzi żelu.

Wyjmij żel z aparatury do elektroforezy SDS-PAGE i zabarw go błękitem Coomassie. Na podstawie wyników barwienia zidentyfikuj frakcje zawierające głównie nukleoproteinę wirusa grypy.

Białko NP wirusa grypy A ma wielkość około 56 kilodaltonów i jest głównym białkiem występującym w wirusowych kompleksach rybonukleoproteinowych. W związku z tym prążek NP jest zazwyczaj najsilniejszym prążkiem w frakcjach zawierających VRNP. W kolejnej części skoncentrujemy te frakcje VRNP.

Połączyć frakcje glicerolu zawierające głównie NP i rozdzielić je do dwóch poliwęglanowych probówek do wirowania Beckman o wymiarach 11 mm na 34 mm, napełniając każdą probówkę wodą ultrapurystyczną traktowaną piroweglanem etylu lub DEPC. Następnie kilkakrotnie pipetować w górę i w dół w celu wymieszania. Umieścić probówki w rotorze Beckman TLA 120.2 i wirować przez cztery i pół godziny przy 157 000 ×g w temperaturze 4 °C.

Po zakończeniu wirowania usunąć nadosad i resuspendować osad. Oczyszczone V NPS podzielić na alikwoty po 50 µL wody traktowanej DEPC; jedną alikwotę odłożyć, a pozostałe przechowywać w temperaturze -80 °C. Teraz można przystąpić do barwienia negatywowego VRP.

Należy rozcieńczyć 1 µL oczyszczonego VRNP w 9 µL świeżo przygotowanego i dwukrotnie filtrowanego buforu PBS oraz poddać działaniu wyładowań żarowych miedzianą siatkę do TEM przez 30 s. Siatka ta została wcześniej pokryta warstwą Parlow Dion i filmu węglowego. Trzymając pęsetą świeżo poddaną wyładowaniom żarowym siatkę, należy nanieść na nią kroplę 5 µL rozcieńczonego VRNP.

W czasie oczekiwania pozwól kropli wniknąć w siatkę przez osiem minut. Umieść mały pasek papieru filtracyjnego w kuwecie, a następnie nanieś na niego dwie krople po 10 µL buforu PBS oraz kroplę 80 µL świeżo przygotowanego roztworu barwiącego, składającego się z 1%mielianu amonu. Następnie przemyj siatkę z preparatem, ostrożnie zanurzając ją w dwóch kroplach PBS przez łącznie jedną minutę.

Następnie, używając kawałka papieru filtracyjnego, odsącz część roztworu próbki z siatki z preparatem, nie dopuszczając do jej wyschnięcia. Natychmiast po odsączeniu ostatniej kropli buforu z siatki, całkowicie zanurz ją w kropli barwnika. Odczekaj jedną minutę.

Po jednej minucie należy użyć nowego kawałka papieru filtracyjnego, aby całkowicie odsączyć roztwór barwiący z siatki z preparatem. Pozostawić siatkę z preparatem do wyschnięcia na powietrzu przez kilka minut przed obserwacją. Poniżej przedstawiono reprezentatywne obrazy z transmisyjnego mikroskopu elektronowego dla ujemnie barwionych V nps.

Jak widać tutaj, V NPS przypominają cząsteczki w kształcie pręcików o zmiennej długości, wynoszącej w przybliżeniu od 30 nanometrów do 120 nanometrów. Oligomeryczna NP jest zorganizowana jako łańcuch cząsteczek NP, który jest następnie zwinięty w strukturę powtarzalnej podwójnej helisy. W związku z tym na końcach tych pręcików czasami można dostrzec pętle.

Właśnie pokazaliśmy, jak oczyszczać i wizualizować kompleksy wirusowych rybonukleoprotein grypy. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby nie używać PBS do rozcieńczania vRNPs, jeśli do barwienia negatywowego stosowany jest octan uranylu.

To wszystko. Dziękujemy za obejrzenie i powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.