Bezpośrednie wznowienie ruchu widelca replikacyjnego zablokowanego przez polimerazę RNA w kolizji czołowej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obserwacja losów strefy replikacji (Repli zone) oraz polimerazy RNA (RNAP) po kolizji czołowej. Osiąga się to najpierw poprzez zmontowanie kompleksu transkrypcyjnego na biotynilowanym DNA i unieruchomienie go na tabletkach i kuleczkach Stripp, co skutkuje powstaniem zatrzymanego kompleksu elongacyjnego RNAP. Drugim krokiem procedury jest ligacja odpowiednio przygotowanego rozwidlonego DNA do kompleksu elongacyjnego RNAP w celu utworzenia widełek replikacyjnych poniżej (downstream) RNAP uczestniczącej w kolizji czołowej.

Trzecim krokiem procedury jest przygotowanie strefy replikacji i zainicjowanie syntezy nici prowadzącej w widelcu replikacyjnym. Ostatnim krokiem procedury jest izolacja DNA z kulek magnetycznych i oczyszczenie DNA za pomocą kolumny do oczyszczania produktów PCR. W rezultacie, poprzez elektroforezę w żelu alkalicznym oczyszczonych, znakowanych promieniotwórczo produktów DNA, można uzyskać wyniki wykazujące, że roso zatrzymuje się w momencie kolizji z czołowo skierowanym kompleksem transkrypcyjnym.

Witajcie, jestem Richard Pomerance z laboratorium Mike'a O'Donnella na Uniwersytecie Rockefeller. Dzisiaj zaprezentuję procedurę wywoływania kolizji rybosomu z polimerazą RNA w fazie stałej. Stosuję tę procedurę w naszym laboratorium, aby badać, w jaki sposób proces replikacji jest wpływany przez kompleksy transkrypcyjne wzdłuż DNA.

Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć ten protokół, zmieszaj holoenzym RNAP z biotynilowaną matrycą DNA o długości 3,6 KB zawierającą promotor T7 A1 w 100 µL buforu A; inkubuj mieszaninę przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Po 10-minutowej inkubacji dodaj rybonukleotydy: adenozyno-trifosforan, cytydylo-fosforan oraz urydylo-fosforan, co ograniczy syntezę RNA do 20 nukleotydów.

Inkubuj roztwór przez dodatkowe 10 minut w temperaturze 37 °C, aby unieruchomić zatrzymany kompleks elongacyjny RN ape na kuleczkach. Dodaj roztwór do magnetycznych kuleczek pokrytych streptawidyną. Pozostaw mieszaninę do inkubacji na 10 minut w temperaturze pokojowej.

Oczyść unieruchomiony kompleks zatrzymanej elongacji RNAP, przemywając kulki 0,9 mililitrami buforu wysokosolnego. Aby usunąć niespecyficzne kompleksy R-N-A-P-D-N-A po każdym przemyciu, usuń supernatant za pomocą separacji magnetycznej. Czynność przemywania należy powtórzyć pięciokrotnie.

Następnie kuleczki należy przemyć dwukrotnie 0,9 ml buforu A. Po końcowym przemyciu można złożyć widelce replikacyjne w kierunku downstream w odniesieniu do zatrzymanej polimerazy RNA (RNAP). Kuleczki magnetyczne przyłączone do zatrzymanego kompleksu elongacyjnego RNAP resuspendowano w 100 µl buforu 4 firmy New England Biolabs. Następnie należy dodać 10 jednostek krewetkowej fosfatazy alkalicznej (SAP) i inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Kuleczki należy przemyć trzykrotnie 0,9 ml buforu A. Następnie kuleczki resuspendowano w 50 µl buforu do szybkiej reakcji ligacji T4.

Dodaj 2 µL ligazy T4 oraz przygotowane rozwidlone DNA, a następnie inkubuj roztwór przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Na koniec przemyj kuleczki jeszcze trzykrotnie 0,9 ml buforu A. Wymieszaj heksamer, helikazę DNA z magnetyczną streptawidyną i kuleczkami, które są przyłączone do zatrzymanego kompleksu elongacyjnego RNAP oraz znajdującego się poniżej rozwidlenia replikacyjnego. Przygotuj roztwór w 150 µL buforu A i inkubuj go przez 30 sekund w temperaturze 23 °C.

Po krótkiej 32-minutowej inkubacji w temperaturze 23°C dodaj do polimerazy trzech beta-zacisku ATP, DGTP, dATP, znakowany α-P³² DGTP oraz znakowany α-P³² dATP do uzyskania objętości 200 µL. Inkubuj próbkę przez pięć minut w temperaturze 37°C.

Rozpocząć replikację, dodając białko wiążące jednoniciowe DNA, DCTP i DTTP. Dodać również znakowany $\alpha$ P 32 DTTP i DCTP do końcowej objętości 250 µL. Po 10 minutach przerwać reakcje, dodając 12 µL 0,5 M EDTA.

Następnie zagotuj kuleczki strp din, aby uwolnić z nich DNA. Usuń resztkowe DNA, traktując kuleczki proteinazą K przez 30 minut w temperaturze 50 °C. Ponownie zagotuj kuleczki i usuń nadsącz za pomocą separacji magnetycznej.

Oczyść połączony nadsącz zawierający DNA przy użyciu zestawu do oczyszczania PCR firmy Kyogen. Następnie przeanalizuj oczyszczone, znakowane radioaktywnie produkty DNA w alkalicznym żelu agarozowym. Kolizja strefy z RNAP zazwyczaj prowadzi do powstania dwóch produktów o długości 2,5 KB i 3,6 KB. Produkt o długości 2,5 KB odpowiada długości DNA od widelca do zatrzymanej RNAP.

Jest to wynik zatrzymania replisomu po kolizji z RNAP. Produkt o wielkości 3,6 KB reprezentuje pełnowymiarowy DNA i wynika albo z niepełnego zajęcia promotora przez RNAP, albo z częściowego odczytu replisomu przez RNAP w kolizji czołowej. Dobry wynik wykazuje, że powstaje około 50% pełnowymiarowego DNA.

Jednak w niektórych przypadkach występuje mniejsze stopień obsadzenia promotora przez RNAP i obserwuje się wyższy odsetek pełnowymiarowego DNA. Dzieje się tak, ponieważ większa populacja stref replikacji nie napotyka RNAP w układzie czołowym; replikacja w obecności zatrzymanego RNAP prowadzi jedynie do powstania pełnowymiarowego DNA. Przedstawiliśmy właśnie sposób przeprowadzenia replikacji w fazie stałej w obecności zatrzymanego kompleksu elongacyjnego polimerazy RNA związanego z DNA. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest przemycie zatrzymanego kompleksu transkrypcyjnego roztworem o wysokim zasoleniu w celu usunięcia nadmiaru polimerazy RNA, która wiąże się niespecyficznie z DNA i hamuje replikację.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.