Metody pomiarów pojemności metodą patch-clamp w kaliksie

Witajcie, nazywam się Ken Paradiso. Pracuję u Ling Gang Wu w programie wewnątrzinstytutowym Narodowego Instytutu Zaburzeń i Udarów Neurologicznych (National Institute of Neurological Disorders and Stroke), który znajduje się w kampusie NIH w Bethesda. Przedstawię Państwu techniki rejestracji presynaptycznej z wykorzystaniem patch-clampu w kaliksie.

Aby przygotować tkankę mózgu, usuwamy mózg szczura. Umieszczamy go w tym roztworze, który powinien być lodowaty, z niską zawartością wapnia i napowietrzany karbogenem, aby zapewnić stały dopływ tlenu do mózgu. Roztwór musi być również lodowaty, aby zminimalizować zakres uszkodzeń.

Mózg znajduje się teraz w tym roztworze. Wyjmujemy go i odpowiednio przycinamy, aby można go było umieścić na bloku, a następnie montujemy na bloku za pomocą Sano correlate lub kleju kropelkowego. Następnie wypełniamy komorę lodowatym roztworem o niskiej zawartości wapnia, napowietrzamy go, umieszczamy na wibratorze, a następnie wykonujemy skrawki o grubości od 180 do 190 µm, przy częstotliwości ostrza 70 Hz i prędkości posuwu od 0,01 do 0,02 mm/s. Odpowiada to prędkości od 10 do 20 µm/s.

Po wykonaniu każdego przekroju przenosimy go z lodowatego roztworu soli fizjologicznej do tej komory, która zawiera standardowy roztwór wapnia. Jest to ten sam roztwór, w którym przeprowadzamy rejestrację, i ma on temperaturę fizjologiczną 37 °C. Następnie umieszczamy tu przekroje w celu ich regeneracji.

Pozostaje ono tutaj od pół godziny do godziny przed przeprowadzeniem eksperymentów fizjologicznych. Mam tutaj mózg i teraz wyjmę go z roztworu. Na potrzeby demonstracyjne używam tutaj większego mózgu.

To jest szczur w 20. dniu po urodzeniu (P 20). Odwrócimy go. Interesuje nas pień mózgu.

Zatem ten obszar tutaj na dole oraz kielich zostały utrzymane mniej więcej w tym miejscu. To, co teraz zrobimy, to odcięcie reszty mózgu, wyizolowanie pnia mózgu, a następnie przygotowanie pnia mózgu do komory do krojenia. Dobrze, zatem odetniemy resztę mózgu, izolując jedynie pień mózgu.

Odwrócę go, aby pokazać, na jakim jesteśmy etapie. Normalnie nie robilibyśmy tego w ten sposób i ponownie zaznaczam, że całą tę część możemy po prostu usunąć. Odwracając go z powrotem, wyizolowaliśmy pień mózgu i wykonamy teraz kolejne cięcie dokładnie w tym miejscu.

Dobrze, to wszystko. To jest pień mózgu. Kielichy Heldowe znajdują się mniej więcej tutaj i tutaj.

To jest pień mózgu. Ponownie odsunie go nieco do tyłu. Odetniemy jedną stronę móżdżku, co pozwoli pniowi mózgu spocząć bokiem w ten sposób.

Nakładamy niewielką ilość akrylowego kleju Sano, a trzymając go poziomo, szybko wypełniamy go zimnym lodem oraz zimnym roztworem o niskiej zawartości wapnia. Jak najszybciej wprowadzamy linię tlenową. Teraz podnosimy próbkę i przenosimy ją do wibratora.

Wprowadzamy go szybko, aby dotrzeć do początku mózgu, a następnie, po dotarciu do tego miejsca, zmniejszamy prędkość do 0,01 mm/s. Jest to zatem 10 µm/s. Prędkość przemieszczania jest zatem niezwykle niska.

Pierwszą częścią mózgu jest obszar zawierający mtb, czyli przyśrodkowe jądra ciała trapezowatego. Jest to część, która zawiera... dobrze, gdy mam już go w pipecie transferowej, staram się przesunąć go jak najbliżej końcówki pipety. Oto plaster mózgu, który dość szybko przenoszę do tej komory, zawierającej standardowy roztwór do rejestracji z normalnym poziomem wapnia oraz w wyższej temperaturze.

Pozwoli to plastrom odzyskać równowagę po procedurach krojenia, tak aby były gotowe do eksperymentów fizjologicznych. Dobrze, od tego momentu czynności będą się powtarzać. Do wykonania metody patch clamp będę używać następującego sprzętu.

Posiadamy odwrócony mikroskop z nieruchomym stolikiem. Stolik jest stały, jak wspomniałem, zatem mikroskop przesuwa się pod nim za pomocą manipulatora. Do podtrzymania stolika używamy mikromanipulatora Wigs i Newman, a jako głowicę wzmacniacza wykorzystujemy wzmacniacz patch-clamp EPC 10 firmy HEKA.

Powinienem również wspomnieć, że w technice DIC używamy światła podczerwonego. Posiadamy tutaj kamerę IR, dzięki czemu wszystko, co widzimy podczas poszukiwania CAE, będzie wyświetlane na ekranie. Wzmacniacz patch-clamp jest sterowany za pomocą oprogramowania Pulse, również firmy Heka, które kontroluje wzmacniacz oraz cały przebieg eksperymentu fizjologicznego.

Wyniki zostaną wyświetlone na tym ekranie. Wybrany kielich jest dużym zakończeniem presynaptycznym, a dzięki jego rozmiarom możliwe jest fizyczne nałożenie pipety (patch-clamp) na zakończenie. Dzięki temu możemy rejestrować sygnały presynaptyczne, co jest rozwiązaniem dość unikalnym, szczególnie w obrębie OUN.

Pozwala to na pomiar kanałów wapniowych aktywowanych presynaptycznie. Możemy również mierzyć aktywność potencjału czynnościowego, gdybyśmy chcieli stymulować nerw prowadzący do kielicha. W tym laboratorium mierzymy proces zwany egzocytozą, który polega na fuzji pęcherzyków zawierających neuroprzekaźnik z błoną.

Teraz pęcherzyki te łączą się z błoną w procesie zwanym egzoctozą, dodając nową błonę do zakończenia synaptycznego, co możemy zmierzyć jako zmianę pojemności elektrycznej. Otrzymamy wzrost pojemności w miarę dodawania błony do zakończenia, zatem eksperymenty, które zaprezentuję dzisiaj, to pomiary pojemności presynaptycznej w momencie, gdy błona jest usuwana. Nie można przecież w nieskończoność dodawać błony, trzeba oczywiście część z niej usunąć.

Proces ten nazywa się endocytozą lub pobieraniem błonowym. Możemy go również pomieścić, co objawi się jako spadek poziomu pojemności elektrycznej; przykłady tego zjawiska przedstawimy w dalszej części. Dzięki temu możemy monitorować aktywność kanałów wapniowych, a także śledzić i badać niektóre z białek biorących udział w egzocytozie i endocytozie.

Możemy wprowadzać substancje takie jak peptydy, aby zablokować białka zaangażowane w egzocytozę lub endocytozę. Możemy również stosować toksyny, które pełnią tę samą funkcję. Możemy także regulować ilość wapnia dostającego się do zakończenia, co pozwala nam na szczegółowe badanie procesu egzocytozy, uwalniania neuroprzekaźnika, a także następującego po tym zdarzeniu pobierania błony.

Jest to probówka zawierająca nasz roztwór do rejestracji wewnątrzkomórkowej. Przygotowujemy go z wyprzedzeniem, a następnie mrozimy; zazwyczaj możemy go używać przez kilka tygodni do miesiąca, zanim będzie konieczne przygotowanie nowej partii roztworu. Ponownie, rozważyliśmy to bezpośrednio przed rozpoczęciem rejestracji, ponieważ do probówki zawsze dostanie się pewna ilość cząsteczek kurzu lub innego rodzaju zanieczyszczeń.

Można postąpić na dwa sposoby. Można albo wyjąć roztwór i go przefiltrować, albo wirować go przez minutę lub dwie, a następnie odlać roztwór, pozostawiając na dnie osad zawierający zanieczyszczenia i inne materiały. Wolę metodę wirowania i zrobię to teraz.

Oto probówka zawierająca nasz roztwór wewnątrzkomórkowy. Jest on rozmrożony. Wirujemy go przez około dwie do trzech minut w małej wirówce, co powinno wystarczyć do usunięcia z roztworu wszelkich dużych cząstek kurzu.

Teraz po prostu pobieram górną warstwę roztworu, który właśnie wirowaliśmy, uważając, aby go nie wstrząsnąć, i przenoszę go do czystej probówki, pobierając około 90% objętości. Staram się ponownie nie pobierać ostatniej niewielkiej części. Zatrzymam się zatem w tym miejscu.

Umieściłam to natychmiast na lodzie, aby podczas eksperymentu zachować niską temperaturę. Jest to bardzo ważne. To jest jedna z naszych pipet.

Używamy ich do rejestracji wewnątrzkomórkowej. Jest to szkło krzemionkowe o grubej ściance, o średnicy zewnętrznej 2 mm i średnicy wewnętrznej 1,16 mm. W pierwszej kolejności wypełniamy pipetę od tyłu.

Następnie stosujemy ssanie: zanurzamy pipetę w roztworze rejestrującym i wysysamy płyn, aby wypełnić samą końcówkę pipety, która w przeciwnym razie nie wypełniłaby się w żaden inny sposób. Po wykonaniu tej czynności używamy rurki kapilarnej, aby wypełnić resztę elektrody, opierając się o tył pipety. Jest to standardowa technika fizjologiczna, polegająca dosłownie na szybkim strząśnięciu pipety.

Ryzykują Państwo uszkodzenie końcówki pipety, jednak w przeciwnym razie często pojawiają się pęcherzyki powietrza. Teraz umieszczamy ją w uchwycie do pipety, który jest połączony z głowicą wzmacniacza patch-clamp. Znajduje się tam drucik z chlorku srebra.

Drut z chlorkiem srebra styka się z roztworem wewnątrzkomórkowym, co pozwala nam mierzyć aktywność elektryczną w terminalu presynaptycznym. W związku z tym znajdujemy skrawek, który zawiera wiele CAEs. Zależy nam na wysokiej gęstości CAEs.

Zatem szukamy przyśrodkowego jądra ciała trapezowatego (MNTB), w którym znajduje się zakończenie tworzące calyx app. W tym celu rozpoczynamy skanowanie przekroju. Na przykład, tutaj widzimy calyx, który znajduje się nieco głębiej pod powierzchnią i nie ma zbyt wiele punktów zaczepienia, więc kontynuujemy skanowanie w poprzek.

Tutaj znajduje się kielich, który chcemy pobrać. Na ekranie zaznaczyłem dwa punkty, w których znajdzie się pipeta. Widać fragment kielicha, który zostanie pobrany w miejscu, gdzie zostanie opuszczona pipeta.

Zastosuję nadciśnienie, aby wypchnąć kielich w górę, a następnie je zniosę. Wówczas kielich dociśnie do pipety; w tym momencie zastosuję bardzo delikatne ssanie, aby wciągnąć membranę lub doprowadzić do jej uszczelnienia na końcówce pipety. Dobrze, nadciśnienie zostało zniesione.

A teraz zastosuję ssanie. Tutaj przykładamy impuls o napięciu 5 mV, a właściwie 4 mV. Dobrze, to wszystko. Dobrze.

Teraz obniżamy potencjał błonowy do -80, aby wyeliminować szybki prąd przejściowy. Teraz przejdziemy do konfiguracji whole-cell. Zastosuję delikatne podciśnienie i spróbuję uzyskać konfigurację whole-cell.

Te przejściowe prądy ładowania wskazują, że pipeta i komórka tworzą teraz ciągłość, co oznacza uzyskanie pełnego zapisu. To kolejne świetne ujęcie. Jaśniejsza czerwona linia to ślad pojemności; widać na nim gwałtowny skok, po którym nastąpił spadek.

Właśnie przedstawiłem podstawowe techniki rejestracji sygnałów z presynaptycznego zakończenia typu calyx. Pokazałem, jak przygotować skrawki zawierające jądro przyśrodkowe ciała trapezowatego, w którym znajdują się wspomniane zakończenia typu calyx.

Przedstawiłem Państwu techniki przeglądania przekrojów. Należy przejrzeć każdy z przekrojów w poszukiwaniu tego, który zawiera największą liczbę komórek caly znajdujących się na powierzchni. Następnie należy odnaleźć największą dostępną membranę komórki caly i przeprowadzić pomiar metodą patch-clamp.

Przedstawiłem również techniki rejestracji metodą patch-clamp, a są to standardowe techniki rejestracji metodą patch-clamp.