Przygotowanie, oczyszczanie i charakterystyka kompleksów lantanowców do zastosowania jako środki kontrastowe w obrazowaniu rezonansem magnetycznym

Ogólnym celem niniejszej procedury jest synteza, oczyszczanie i charakterystyka kompleksów zawierających lantanowce, które mogą być wykorzystywane do znakowania biologicznych makrocząsteczek. Osiąga się to poprzez wstępne zmieszanie materiału wyjściowego metalu z ligandem przy jednoczesnej kontroli pH roztworu. Drugim etapem procedury jest oczyszczenie otrzymanego kompleksu za pomocą dializy.

Następnie należy zweryfikować brak wolnego metalu. Ostatnim etapem procedury jest charakterystyka właściwości kompleksu istotnych dla obrazowania. W końcowym etapie, poprzez pomiary aktywności relaksacyjnej, można uzyskać wyniki wykazujące, że zsyntetyzowane kompleksy będą zachowywać się jako środki kontrastowe.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie obrazowania, takie jak to, czy liczba koordynacyjna wody w środku kontrastowym ulega zmianie po związaniu z białkiem. Zazwyczaj osoby potrzebujące tej metody będą napotykać trudności, ponieważ brak starannej kontroli pH doprowadzi do uczynienia LI bezużytecznym w edukacji biologicznej. Demonstrację dializy oraz pomiarów aktywności przeprowadzą Buda i Sashi.

Studenci studiów doktoranckich z mojego laboratorium, aby rozpocząć metylację przy użyciu soli lantanowców, najpierw rozpuśćcie jeden ekwiwalent ligandu w wodzie, aby otrzymać roztwór o stężeniu od 30 do 265 mM. Ligand Paraiso Benzyl DTPA jest tutaj stosowany w stężeniu 73 mM. Następnie dostosujcie pH roztworu ligandu do wartości od 5,5 do 7 poprzez dodanie 1 M wodorotlenku amonu.

W tym filmie 0,2 mililitra jednomolowego roztworu wodorotlenku amonu jest wykorzystywanych do rozpuszczenia od jednego do dwóch ekwiwalentów chlorku lantanowca w wodzie, aby otrzymać roztwór o stężeniu od 5 do 1000 milimolarnych. Można zastosować chlorek eurobu lub chlorek gadolinu w stężeniach 111 milimolarnych. Często stosuje się nadmiar metalu, aby doprowadzić reakcję do końca i tym samym uprościć proces oczyszczania.

Następnie, przy ciągłym mieszaniu, dodaj każdy z roztworów soli lantanowców do przygotowanego roztworu ligandu. Następnie dostosuj pH otrzymanych mieszanin reakcyjnych do wartości od 5,5 do 7, dodając 0,2 M wodorotlenek amonu. W tym celu do dostosowania roztworu wykorzystuje się łącznie 0,5 ml 0,2 M roztworu wodorotlenku amonu.

Jeśli stosowany ligand zawiera grupy funkcyjne wrażliwe na kwas, należy wielokrotnie korygować pH podczas tego etapu. Należy zachować ostrożność przy regulacji pH, ponieważ jeśli roztwór stanie się zbyt zasadowy, wszelkie grupy funkcyjne wrażliwe na zasady, takie jak izotiocyjaniany, staną się bezużyteczne. Podczas koniugacji należy ściśle monitorować przebieg reakcji za pomocą pomiarów pH.

Reakcja jest zakończona, gdy pH pozostaje stałe. W przypadku ligandów pozbawionych grup funkcyjnych wrażliwych na zasady przydatne może być również opracowanie próbki polegające na podniesieniu wartości pH. Aby rozpocząć proces dializy, należy wyznaczyć odpowiednią długość membrany dializacyjnej, która pomieści objętość próbki oraz dodatkową długość odpowiadającą 10% objętości próbki. Następnie, zgodnie z wytycznymi producenta, należy przyciąć membranę do tej długości.

W tym filmie zastosowano membranę z progiem odcięcia masy cząsteczkowej od 100 do 500 Daltonów, jednak w zależności od potrzeb można użyć tubingów o większym progu odcięcia masy cząsteczkowej, jeśli konjugacja zostanie przeprowadzona przed metylacją. Jeśli jest to wymagane, zgodnie z wytycznymi producenta, należy namoczyć odcięty tubing do dializy w wodzie przez 15 minut w temperaturze otoczenia. Następnie należy napełnić zbiornik do dializy wodą, która będzie pełnić rolę dializatu. W tym przypadku wykorzystano zlewkę o pojemności jednego litra.

Objętość dializatu powinna być około 100-krotnie większa od objętości próbki. Następnie należy dwukrotnie zagiąć jeden koniec rurki i zabezpieczyć zagiętą część za pomocą zacisku do dializy. Koniec zacisku należy owinąć gumką recepturką, aby upewnić się, że pozostanie on zamknięty podczas dializy.

Przefiltruj wcześniej przygotowaną mieszaninę reakcyjną przez filtr 0,2 mikrona. Następnie wprowadź filtrat do otwartego końca rurki, uważając, aby nie przerwać jej ciągłości.

Należy pozostawić wystarczającą ilość wolnej przestrzeni nad próbką, aby móc zamknąć rurkę. Pozostały otwarty koniec rurki należy złożyć dwukrotnie, a następnie zabezpieczyć zatyczką i owinąć ją gumką recepturką. Następnie, za pomocą kolejnej gumki recepturki, należy przymocować szklaną fiolkę zawierającą powietrze do zacisku na jednym z końców rurki dializacyjnej.

Następnie do drugiego zacisku przymocuj fiolkę z piaskiem. Fiolki te zapewniają, że cewka pozostaje zanurzona w dializacie. Teraz umieść całą cewkę w zbiorniku do dializy zawierającym dializat.

Mieszać dializat za pomocą mieszadła magnetycznego z małą prędkością w temperaturze pokojowej. Należy upewnić się, że prędkość mieszania pozostaje niska i że roztwór nie jest poddawany wstrząsaniu w wortexie. Wymienić dializat trzy razy w ciągu jednego dnia.

W tym filmie dializat jest wymieniany w 2,5, 6,5 i 11,5 godzinie. Dializę należy kontynuować przez noc, przez łącznie od 20 do 28 godzin. Po zakończeniu dializy należy wyjąć rurki z dializatu i ostrożnie otworzyć jedno zamknięcie, aby wyjąć próbkę.

Przepłucz membranę dializacyjną trzykrotnie wodą, a powstałe odcieki połącz z próbką. Na koniec usuń wodę z próbki w warunkach obniżonego ciśnienia. Zostaje to osiągnięte poprzez liofilizację.

Próbkę zamraża się, a następnie umieszcza w aparaturze do liofilizacji. Aby ocenić obecność wolnych metali w próbce, w pierwszej kolejności należy przygotować bufor octanowy poprzez rozpuszczenie 1,4 milliliters kwasu octowego w 400 milliliters wody, dostosować pH do 5,8 za pomocą jedno molarnego wodorotlenku amonu, a następnie dodać wodę do uzyskania całkowitej objętości 500 milliliters. Następnie należy rozpuścić 0,3 milligrams każdego kompleksu w 0,3 milliliters buforu.

Teraz należy przygotować wskaźnik xol orange, którego stężenie w buforze o pH 5.8 powinno wynosić 16 µM. Do wcześniej rozpuszczonych kompleksów metali należy dodać trzy ml tego roztworu wskaźnika. Obecność wolnego metalu wykrywa się poprzez obserwację zmiany barwy wskaźnika z żółtej na fioletową.

W razie potrzeby ilość wolnego metalu można określić ilościowo poprzez sporządzenie krzywej kalibracyjnej. Jeśli w próbce pozostał wolny metal, należy ją dodatkowo oczyścić za pomocą dializy lub wysokosprawnej chromatografii cieczowej przed przeprowadzeniem charakterystyki. Następnie, aby wyznaczyć liczbę koordynacyjną cząsteczek wody dla próbki opium, należy przygotować roztwór kompleksu zawierającego opium o stężeniu około 1 mM w wodzie oraz drugi roztwór o tym samym stężeniu w tlenku deuteru.

Przed przeprowadzeniem analizy roztwór wody ciężkiej należy odparować i ponownie rozpuścić w wodzie ciężkiej trzykrotnie, aby usunąć resztkową wodę. Następnie należy włączyć spektrofluorymetr, przelać roztwór wodny do czystej kuwety i umieścić kuwetę w spektrofluorymetrze. Należy teraz przeprowadzić pomiary wzbudzenia i emisji, aby wyznaczyć ich maksima, które wynoszą odpowiednio około 395 nanometrów i 595 nanometrów. Następnie należy przeprowadzić eksperyment badania czasu zaniku fosforescencji, wykorzystując właśnie wyznaczone długości fal wzbudzenia i emisji oraz parametry wyświetlone tutaj.

Powtórz ten krok, używając przygotowanego roztworu tlenku deuteru. Na podstawie uzyskanych danych o zaniku luminescencji wykreśl logarytm naturalny natężenia w funkcji czasu. Nachylenie tych linii stanowi szybkość zaniku. W tym filmie do generowania wykresów logarytmu naturalnego z surowych danych wykorzystano program Microsoft Excel 2007.

Należy zastosować szybkości rozpadu w równaniu opracowanym przez Horsa i współpracowników, przedstawionym tutaj. Jeśli ligand zawiera grupy OH lub NH skoordynowane z metalem, równanie musi zostać zmodyfikowane przed użyciem. Aby wyznaczyć pomiary relaksacyjne próbki, w pierwszej kolejności należy wybrać na analizatorze czasu relaksacji pożądany tryb aplikacji: T1 lub T2.

W tym miejscu wybrano ustawienie T1. Następnie należy przygotować serię próbek zawierających różne stężenia kompleksu lantanowca w rozpuszczalniku wodnym. Jako rozpuszczalnika użyto wody, a roztwory przygotowano w stężeniach 5, 2, 0,5, 1,25, 0,625 oraz 0.

Przygotowuje się roztwory milimolarne. Można stosować inne odpowiednie rozpuszczalniki lub bufory, jednak ważne jest, aby użyć danego rozpuszczalnika jako próbki ślepej. Końcowa objętość próbki zależy od używanego urządzenia.

Umieść próbkę w urządzeniu i pozostaw ją na pięć minut, aby wyrównała temperaturę do temperatury instrumentu, która w przypadku jednostki użytej w tym filmie wynosi 37 °C. Następnie wyznacz czas relaksacji w sekundach, dostosowując parametry oprogramowania tak, aby uzyskać gładką krzywą wykładniczą dla T1 lub T2. Powtórz tę procedurę dla wszystkich próbek, w tym dla próbki ślepej.

Następnie należy obliczyć odwrotności zmierzonych wartości relaksacji T1 lub T2 i nanieść je na wykres. Wartości te należy nanieść w funkcji stężenia lantanowca w jednostkach milimolarnych, a następnie dopasować do wykresu linię prostą. Nachylenie dopasowanej prostej stanowi aktywność relaksacyjną R1 lub R2 odpowiednio dla T1 i T2.

Tutaj przedstawiono ogólny schemat mediacji i oczyszczania. Schemat ten obrazuje ogólną procedurę metylacji oraz powody wyboru różnych ścieżek oczyszczania. Widzimy tutaj reprezentatywny wykres zaniku luminescencji, na którym naturalny logarytm zaniku jest naniesiony w funkcji czasu; nachylenia linii wyznaczonych z podobnych krzywych dla roztworów wody i tlenku deuteru są wykorzystywane w równaniu jeden do wyznaczenia liczby koordynacyjnej cząsteczek wody w kompleksach zawierających opu.

Reprezentatywny przykład pomiarów livity przedstawiono tutaj, gdzie nachylenie dopasowanej linii stanowi livity T1 próbki. Oprócz liczby koordynacyjnej wody i charakterystyki livity opisanej w protokole, ważne jest również scharakteryzowanie produktów końcowych przy użyciu standardowych technik chemicznych. Tożsamość związku można ustalić za pomocą spektrometrii mas; tutaj przedstawiono reprezentatywne widma masowe wykazujące diagnostyczne wzory izotopowe dla kompleksów zawierających gadolin i opium.

Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak spektroskopia IR, HPLC i analiza elementarna, w celu dalszej charakterystyki otrzymanych kompleksów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat syntezy, oczyszczania i charakterystyki kompleksów zawierających lantanowce, które mogą być wykorzystywane do znakowania biologicznych makrocząsteczek.