Analiza nakładkowa białek błonowych: protokół badania interakcji między białkami rozpuszczalnymi a nierozpuszczalnymi in vitro

Testowanie białek. Oddziaływania białkowe są niezbędne do analizy funkcjonalności białek. Niniejszy film prezentuje test wiązania białko-białko in vitro, służący do badania oddziaływań między białkiem błonowym lub unieruchomionym a białkiem rozpuszczalnym.

W pierwszej kolejności białka fuzyjne są klonowane, ekspresowane i ekstrahowane. Znaczone białko nierozpuszczalne jest unieruchamiane na membranie nitrocelulozowej, a następnie poddawane procesowi refoldingowi w celu przywrócenia jego natywnej konformacji. Membrana jest następnie inkubowana ze znakowanymi białkami rozpuszczalnymi, po czym przeprowadza się immunoblotting w celu wykrycia białek.

Jeśli oznakowane białka oddziałują ze sobą, zostają one wychwycone przez białko unieruchomione na membranie, co pozwoli na zaobserwowanie sygnału w immunoblottingu. W ten sposób badanie to stanowi niezawodną metodę testowania oddziaływań pomiędzy białkiem nierozpuszczalnym a białkiem w roztworze. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak GST pull down, jest możliwość wiarygodnej oceny wiązania pomiędzy białkiem nierozpuszczalnym a białkiem rozpuszczalnym in vitro.

Pierwszym krokiem tej procedury jest wytworzenie białek z markerami genetycznymi w celu ich detekcji. Należy rozpocząć od klonowania białka, które zostanie unieruchomione na membranie. Oznacza się je jako pro Im (białko unieruchomione) w wektorze ekspresyjnym kodującym duży marker, taki jak GST; pusty wektor ekspresyjny, kodujący jedynie marker, będzie służył jako kontrola negatywna białka unieruchomionego i jest oznaczany jako pro IM nc.

Następnie należy sklonować białko, które będzie służyć jako sonda rozpuszczalna, do wektora ekspresyjnego kodującego inny znacznik, taki jak strep two. Będzie ono określane jako prosol. W celu uzyskania kontroli negatywnej, sklonować rozpuszczalne białko kontrolne do tego samego wektora ekspresyjnego. Będzie ono określane jako Prosol NC (od ang. soluble protein negative control).

Następnie należy wykorzystać system ekspresji białek, taki jak E. coli lub wirus baculowirus, aby wyekspresować białka z przyłączonymi znacznikami. System ekspresyjny powinien zostać starannie wybrany w zależności od wymagań dotyczących modyfikacji potranslacyjnych. Wyekstrahować wyekspresowane białka z wybranego organizmu. Dla pro IM i pro I mnc Resus.

Resuspensuj komórki w buforze do ładowania żelu SDS-PAGE zawierającym koktajl inhibitorów proteaz. Następnie gotuj komórki przez pięć minut, a potem odwiruj je w celu usunięcia osadu, aby wyekstrahować Prosol i prosol NC. Zastosuj standardowe procedury. Pro IMS można ekstrahować w warunkach denaturujących, ponieważ białka ulegną ponownemu sfałdowaniu po unieruchomieniu na błonie nitrocelulozowej.

Należy jednak wyekstrahować prosol, aby uzyskać potwierdzenie natywności, ponieważ zostaną one dodane do buforu wiążącego po wyekstrahowaniu białek z etykietą. Należy określić stężenie białek rekombinowanych za pomocą standardowej metody, takiej jak zestaw do oznaczania białek BioRad. W przypadku, gdy do analizy zostanie użyty ekstrakt surowy zamiast oczyszczonego białka.

Oszacuj stężenie badanego białka za pomocą densytometrii skanującej odpowiadającego mu prążka na żelu SDS-PAGE barwionym kumasą. Jako referencję wykorzystaj znane stężenia BSA. Następnie wykreśl krzywą wzorcową na podstawie intensywności sygnału zmierzonej densytometrią skanującą BSA i oblicz ilość białka zawartą w ekstrakcie surowym.

Kolejnym krokiem procedury jest immobilizacja pro Iam oraz pro IAM NC na membranie. Należy rozpocząć od nałożenia 1 µg ekstraktów pro Iam oraz pro IAM NC, każdy w dwóch powtórzeniach, na żel poliakrylamidowy SDS. Po elektroforezie żel należy wyjąć z szklanych płytek i umieścić w 100 mL buforu do transferu, a następnie inkubować przy łagodnym mieszaniu przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji przeprowadź analizę western blot, aby przenieść białka na membranę nitrocelulozową, a następnie pozostaw membranę, aby związane z nią białka uległy ponownemu sfałdowaniu. Umieść membranę w 15 ml buforu A i inkubuj przy delikatnym mieszaniu. W celu usunięcia pozostałości SDS inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu.

Po inkubacji ostrożnie wyjmij membranę z buforu. Następnie umieść membranę w 25 mililitrach buforu do denaturacji. Inkubuj przez dwie godziny w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu.

Podczas inkubacji membrana nitrocelulozowa stanie się nieprzezroczysta. Następnie, za pomocą pęsety, przenieś membranę do 25 ml TBS i inkubuj przy delikatnym mieszaniu przez pięć minut. Na tym etapie membrana powraca do swojego pierwotnego białego koloru.

Następnie przenieść membranę do 25 ml buforu wiążącego. Inkubować w temperaturze 4 °C przy łagodnym mieszaniu przez noc. W kolejnym kroku białko rozpuszczalne zostanie wykorzystane do sondowania membrany w celu wykrycia białka unieruchomionego.

W pierwszej kolejności należy przygotować bufory do hybrydyzacji, rozcieńczając od 1 do 10 µg prosol oraz prosol NC w osobnych probówkach zawierających 10 ml świeżego buforu wiążącego. Następnie należy przenieść bufor do worka do hybrydyzacji. W kolejnym kroku membranę należy przeciąć na dwa paski, z których każdy zawiera pro IM oraz pro IAM nc.

Membrany te należy umieścić w buforze do hybrydyzacji. Przenieś każdą membranę do roztworu do hybrydyzacji prosol lub prosol NC i inkubuj przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu. Wyjmij membrany z roztworów do hybrydyzacji i wypłucz trzykrotnie przez 15 minut w TBS.

Aby zwizualizować oddziaływania białko-białko, należy zablokować membranę 2,5% mlekiem odtłuszczonym w TBST przez jedną godzinę. Po inkubacji zablokowane membrany należy umieścić w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego. W tym przypadku zastosowano poliklonalne przeciwciało królicze anty-strep two.

Inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu po inkubacji. Płukać membrany w 20 ml TBST przez 15 minut oraz dwukrotnie przez pięć minut w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu. Następnie umieścić membrany w roztworze przeciwciał wtórnych sprzężonych z HRP; w tym przypadku stosuje się przeciwciało anty-rabbit IgG sprzężone z HRP.

Inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu. Przemyć membrany w 20 ml TBST przez 15 minut oraz dwukrotnie przez pięć minut w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu, analogicznie jak poprzednio; po końcowym przemyciu w TBS, zwizualizować oddziaływanie białko-białko przy użyciu chemiluminescencyjnego substratu HRP firmy Millipore (Molan Western Chemiluminescent).

Substrat HRP jest stosowany po immunoblottingu prosolu. Płucz membranę w TBST przez 15 minut, a następnie dwukrotnie przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie inkubuj membrany z przeciwciałem pierwszorzędowym przeciwko znacznikowi pro.

Następnie zastosowano odpowiednie przeciwciało wtórne. Aby zweryfikować tożsamość prążków uzyskanych w teście overlay białek na błonie, zwizualizowano PRO I oraz pro Im NNC poprzez detekcję chemiluminescencji. Interakcję pomiędzy białkami A i K oraz YFP i MP CYFP oceniono w komórkach epidermy tytoniu, stosując metodę opisaną w tym filmie, zgodnie z prezentacją w tym miejscu.

Podczas oceny biomolekularnej komplementacji fluorescencji odtworzono silny sygnał YFP. Sygnał BFC ten gromadził się w punktach (Punta) na obwodzie komórki, co jest charakterystyczne dla błony plazmatycznej, ponieważ MP jest białkiem wysoce nierozpuszczalnym. W przypadku ekspresji w bakteriach lub roślinach, w celu walidacji tej interakcji zastosowano test nakładania białek błonowych (protein membrane overlay assay).

Ekstrakty białkowe in vitro zawierające 1 µg GST MP lub niepołączonego GST rozdzielono za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z SDS, a następnie przeniesiono elektroforetycznie na membranę nitrocelulozową. Po inkubacji tych membran z rozpuszczalnym a nnk strep two, wiązanie wykazywało GST mp, ale nie niepołączone GST. Co więcej, gdy ten sam zestaw membran poddano analizie z użyciem niepowiązanego białka saw nc IE Arabidopsis Cytoplasmic, NADH kinase tagged strep two, nie zaobserwowano wiązania, co dodatkowo potwierdziło specyficzność interakcji A NK MP. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o prawidłowym uzupełnieniu unieruchomionych białek zgodnie z przedstawionym protokołem.