Transfekcja i nukleofekcja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest osiągnięcie wysokiej wydajności transfekcji w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu zoptymalizowanych protokołów transfekcji i nukleofekcji. Zostaje to osiągnięte poprzez uprzednie ustanowienie kultur ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych bez użycia komórek karmicieli. Do transfekcji ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste są wysiewane na gelt, TRX lub matrigel na noc.

Podczas nuklefekcji, za pomocą trypsyny uzyskuje się małe skupiska komórek, do których dodaje się mieszaninę plazmidowego DNA i odczynnika do transfekcji genów, a następnie płytkę wiruje i inkubuje w temperaturze 37°C. Zawiesinę ludzkich komórek iPS poddaje się nuklefekcji za pomocą urządzenia do nuklefekcji, a następnie komórki resuspendsuje się w pożywce warunkowanej i inkubuje w temperaturze 37°C. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące efektywną manipulację genetyczną dzięki wysokiej wydajności transfekcji w ludzkich komórkach iPS.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wcześniej opisana elektroporacja do transfekcji oraz metody nukleofekcji, jest możliwość rutynowego osiągania wysokiej wydajności transfekcji w ludzkich komórkach iPS przy spójnych wynikach w naszym laboratorium. Nasze protokoły zapewniają również minimalną śmiertelność komórek po modyfikacji genetycznej. W związku z tym nasze protokoły umożliwiają szybkie i wielkoskalowe generowanie transgenicznych linii ludzkich komórek iPS. Przed adaptacją ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do kultur bez karmicieli należy przygotować naczynia pokryte Geltrex.

Następnie należy poddać masażowi ludzkie IPCs, utrzymywane wcześniej na komórkach karmicielkach, dodając 1 ml Accutane na dołek i inkubować w temperaturze 37 °C przez jedną minutę, aż większość komórek zacznie się odrywać; następnie dodać 10 do 15 szklanych kulek do komórek i delikatnie potrząsnąć płytką. Następnie dodać 2 ml knockout D-M-E-M-F 12 i delikatnie utriturować. Zawiesinę komórkową przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 10 ml.

Wirować komórki z prędkością 800 RPM przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Odessać nadsącz, pozostawiając nienaruszony osad ludzkich iPSC. Delikatnie uderzyć w probówkę, aby łagodnie rozbić osad komórkowy.

Reese, zawieś osad ludzkich iPSC w odpowiedniej objętości pożywki STEM pro i rozdziel go pomiędzy dołki płytki pokrytej TRE gel. W zależności od tempa proliferacji, ludzkie IPC można pasażować w stosunku rozcieńczenia od 1:2 do 1:6. Ostrożnie umieść płytkę w inkubatorze z 5% carbon dioxide w temperaturze 37 degrees Celsius i delikatnie zakręć płytką, aby zapewnić równomierny rozkład komórek w dołkach.

Dokarmiaj komórki codziennie. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, są gotowe do ponownego pasażowania na nowy żel. W dniu transfekcji, aby uzyskać optymalną wydajność, komórki w dołkach pokrytych Rex przy stosunku rozcieńczenia 1:2 powinny wykazywać konfluencję na poziomie około 40–50% i tworzyć małe kolonie rozmieszczone równomiernie w dołku pokrytym żelem.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować 100 µL pożywki knockout w sterylnym probówce typu eppendorf o pojemności 1,5 mL. Dodać 27 µL odczynnika do transfekcji gene juice, dokładnie wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie dodać 4 µg plazmidowego DNA.

Wybór plazmidu ma kluczowe znaczenie dla optymalnej wydajności transfekcji. Plazmid użyty w tej procedurze zawiera wzmocnione zielone białko fluorescencyjne pod kontrolą promotora CAG, który jest silnym promotorem aktywnym transkrypcyjnie w ludzkich IPC. Inkubuj probówkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

Po 15 minutach dodać mieszaninę DNA (gene juice) do komórek i rozprowadzić ją na płytce. Wirować płytkę z prędkością 1 200 RPM przez pięć minut, aby zwiększyć kontakt mieszaniny transfekcyjnej z ludzkimi IPC w dołkach. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez noc do następnego dnia.

W dniu nukleofekcji należy monitorować wydajność transfekcji; w celu przygotowania ludzkich iPSC należy je wstępnie inkubować z 10 µM inhibitorem ROCK przez co najmniej jedną godzinę w temperaturze 37 °C. W sterylnym probówce typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml przygotować 82 µl roztworu do nukleofekcji ludzkich komórek macierzystych. Dodać 80 µl.

Uzupełnić do odpowiedniej objętości i dobrze wymieszać za pomocą pipetowania. Inkubować roztwór w temperaturze 37 °C przez pięć minut. Poddygestorem podgrzać do 37 °C wcześniej przygotowane medium warunkowane komórkami karmicielnymi oraz 0,25% trypsyny w EDTA.

Należy opisać jedną sterylną probówkę stożkową o pojemności 15 ml. Ostrożnie usunąć medium z hodowli ludzkich iPSC przeznaczonej do transferu jąder i delikatnie przemyć komórki solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS). Odessać PBS i dodać trypsynę, a następnie inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez trzy minuty.

Dla skutecznej nuklefekcji krytyczne jest, aby nie trawić komórek trypsyną do postaci pojedynczych komórek. Zamiast tego komórki należy rozbić przez tryturację na małe skupiska składające się z dwóch do trzech komórek. Delikatnie rozbij komórki za pomocą końcówki pipety P 1000 na małe skupiska składające się z dwóch do trzech komórek.

Wypłucz dno dołka poprzez wielokrotne pipetowanie, aby upewnić się, że wszystkie ludzkie IPC zostały całkowicie ododerwane. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do oznakowanej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Następnie dodaj dziewięć mililitrów pożywki do zarodkowych fibroblastów mysich.

Aby inaktywować trypsynę, wiruj komórki z prędkością 800 RPM przez trzy minuty. Ostrożnie odessij nadsącz, pozostawiając nienaruszony osad komórkowy. Resuspenduj komórki w 100 µL podgrzanego wcześniej roztworu efektora jądrowego dla ludzkich komórek macierzystych.

Używając końcówki do pipety o pojemności 1 mL, przenieś komórki do probówki typu V-bottom. Dodaj 4 µg plazmidowego DNA do zawiesiny komórkowej w probówce, a następnie wymieszaj komórki i DNA delikatnie okrężnymi ruchami. Stuknij probówkę dwukrotnie o powierzchnię dygestorium.

Włóż probówkę do uchwytu efektora jądrowego w urządzeniu do elektroporacji jądra. Wybierz program B 0 1 6 dla komórek poddawanych elektroporacji jądra, naciskając przycisk x; na wyświetlaczu pojawi się komunikat Okay. Po zakończeniu procesu elektroporacji jądra, co zazwyczaj trwa od jednej do pięciu sekund, użyj dołączonej do zestawu plastikowej pipety Pasteura, aby pobrać komórki po elektroporacji z probówki. Odzyskaj komórki poprzez resuspensję w uprzednio ogrzanym medium CM i inhibitorze ROCK w sterylnym probówce typu eppendorf o pojemności 1,5 ml. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez 10 minut.

Po 10 minutach, używając końcówki do pipety o objętości 1 ml, przenieś komórki kroplami na warstwy komórek karmicieli. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez noc do następnego dnia. Monitoruj wydajność transfekcji.

Przedstawione tutaj mikrofotografie ukazują ludzkie komórki iPSC linii RIV one wykazujące ekspresję EGFP, które zostały transfekowane za pomocą odczynnika Gene Juice na żelu Rex 12 godzin po transfekcji. Transfekcja DNA ludzkich iPSCs przy użyciu Gene Juice z silnym promotorem zazwyczaj daje ponad 60% komórek wykazujących ekspresję reportera EGFP w teście transfekcji przejściowej.

Komórki wykazujące ekspresję EGFP można uzyskać również poprzez transfekcję jądrową, co przedstawiono na obrazach ludzkich iPSC RIV one, wysianych i uformowanych na komórkach karmicielkach po transfekcji jądrowej z wykorzystaniem programu transfekcji jądrowej B 0 1 6 lub programu transfekcji jądrowej A 0 2 3. Zastosowanie programu B 0 1 6 skutkuje uzyskaniem do 80% komórek pozytywnych pod kątem EGFP, natomiast program A 0 2 3 przyniósł mniej niż 10% komórek pozytywnych pod kątem EGFP. Ponadto możliwe jest wyizolowanie stabilnych klonów transgenicznych ludzkich iPSC wykazujących ekspresję genu trends.

Tutaj przedstawiono przykład stabilnie ekspresyjnych kolonii ludzkich iPSC z powszechną ekspresją EGFP pochodzącą z gene juice. Komórki te zachowują konstytutywną ekspresję EGFP podczas różnicowania w ciała zarodkowe. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić nuklefekcję i transfekcję ludzkich komórek iPS.

Efektywna manipulacja genetyczna stanowi niezbędne narzędzie do badania różnych aspektów biologii komórek macierzystych i przyspieszy zastosowanie ludzkich linii komórek iPS w medycynie regeneracyjnej.