Przesiewanie RNAi w celu identyfikacji fenotypów postembrionalnych u C. elegans

Celem tej procedury jest zidentyfikowanie porembryonalnych regulatorów ekspresji i lokalizacji białek u C. elegans przy użyciu genomowego przesiewu opartego na RNAi oraz białek znakowanych fluorescencyjnie. Po skonstruowaniu odpowiedniego szczepu do przesiewu wybierana jest biblioteka RNAi. Pierwszym krokiem procedury jest wprowadzenie klonów z biblioteki do bakterii.

Następnie bakterie są selekcjonowane, namnażane i podawane jako pokarm dla nicieni *C. elegans* na określonym etapie rozwoju. Po 72 godzinach wzrostu nicieni obserwuje się pod kątem zmian w badanym fenotypie. Ostatecznie zmiany w ekspresji lub lokalizacji wewnątrzkomórkowej badanego białka są wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Metoda ta pozwala zidentyfikować geny niezbędne do prawidłowej lokalizacji wewnątrzkomórkowej białka znakowanego fluorescencyjnie. Protokół ten można jednak zmodyfikować w celu identyfikacji genów wpływających na inne interesujące fenotypy poembrionalne. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi opublikowanymi protokołami jest to, że zoptymalizowaliśmy spójność i poziom odpowiedzi RNAi u zwierząt poprzez indukcję produkcji dwuniciowego RNA w bakteriach przed wysiewaniem.

Procedurę zaprezentuje Kathy Fuss, pracownik naukowy z mojego laboratorium. W ciągu dwóch miesięcy od rozpoczęcia eksperymentu należy przygotować bibliotekę klonów; w pierwszej kolejności należy wykonać posiew bakterii z wybranych klonów biblioteki żerowania oraz kontroli dodatniej i ujemnej na płytkach LB z tetracykliną. Jako kontrolę dodatnią należy zastosować klon zawierający gen wywołujący fenotyp poembrionalny zależny od dawki, taki jak BLE four. Jako kontrolę ujemną należy zastosować pusty wektor lub klon zawierający przewidywany pseudogen, w przypadku którego nie zaobserwowano żadnych fenotypów.

Inkubuj płytki przez noc. Dla każdego klona zaszczep 2 mL pożywki LB zawierającej 50 µg/mL kwasu karbonowego, używając pojedynczej kolonii z płytek z posiewem kreskowym. Inkubuj kultury przez noc w warunkach wytrząsania. Następnego ranka, gdy roztwory powinny stać się mętne, indukuj produkcję dwuniciowego RNA poprzez dodanie IPTG do kultur i inkubuj je przez dodatkowe cztery do pięciu godzin w tych samych warunkach.

Dodanie IPTG zapewnia bardziej spójne i silne wyciszenie produktu genu indukowane przez RNAi niż poleganie wyłącznie na IPTG i powierzchni płytki NGM. Po inkubacji z IPTG nanieś 30 µl kultury z każdego klonu do poszczególnych studni przygotowanych 24-studziennych płytek NGM do RNAi. Jeden klon na studnię. Każda płytka powinna posiadać dwie studnie przeznaczone dla kontroli.

Dokładnie zaznacz lokalizację każdej biblioteki. Po sklonowaniu na płytki 24-dołkowe umieść płytki bez przykrycia w sterylnym komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby wyschły przez około 20 minut. Nie dopuść do oddzielenia się brzegów agaru od ścianek płytki.

Po wysuszeniu i przeniesieniu nicieni w określonym stadium rozwoju na płytki, podano instrukcje dotyczące przygotowania nicieni. W następnej sekcji należy rozpocząć od populacji nicieni w pierwszym stadium larwalnym lub L1. Rozpoczęcie pracy od larw L1 pozwala uniknąć potencjalnych fenotypów letalnych w stadium embrionalnym.

Posiadanie populacji zwierząt o określonych etapach rozwoju do przesiewania zwiększa również pewność, że wszelkie zaobserwowane różnice wynikają z RNAi, a nie są po prostu naturalnymi różnicami występującymi na różnych etapach. Należy jednak odnotować, jeśli RNAi powoduje opóźnienie rozwoju. Populacja szczepu przesiewowego o mieszanych etapach rozwoju poddana wybielaniu.

Tylko embriony chronione skorupką jaja przeżyją ten etap; zwierzęta osiągną odpowiednie stadium w ciągu 12 godzin, jeśli procedura zostanie przeprowadzona w 20 °C, lub w ciągu 18 godzin, jeśli zostanie przeprowadzona w 16 °C w dniu inokulacji kultur bakteryjnych. Wybierz trzy płytki 100 mm z osobnikami szczepu przesiewowego, które są zdrowe i zawierają zarówno ciężarne osobniki dorosłe, jak i embriony.

Przepłucz wszystkie zwierzęta w sterylnym medium M9 i przelej płuczkę do sterylnej probówki o pojemności 15 ml z nakrętką. Jeśli objętość płuczki przekracza 3,5 ml, odwiruj zwierzęta i usuń nadmiar cieczy, pozostawiając 3,5 ml. Jeśli objętość jest mniejsza niż 3,5 ml.

Zwiększyć objętość do 3,5 mililitrów wodą lub M9, aby uwolnić embriony od osobników dorosłych, dodając do każdego przemycia 1,5 mililitra mieszaniny wodorotlenku sodu i wybielacza. Inkubować zwierzęta w tym roztworze nie dłużej niż 10 minut. Po uruchomieniu stoperem każdy probówkę wierzchać w vortexu przez 10 sekund i powtarzać wierzchanie co dwie minuty.

Po każdym mieszaniu na wortexie należy sprawdzić roztwór pod stereomikroskopem w celu oceny stopnia rozpadu organizmów. W ciągu sześciu do ośmiu minut osobniki dorosłe zostaną pofragmentowane, a embriony powinny zostać uwolnione. Należy oddzielić embriony od roztworu wybielacza poprzez ich odwirowanie i usunięcie jak największej ilości supernatantu, uważając, aby nie naruszyć osadu.

Następnie resuspenduj osad w objętości 10 mililitrów, dodając sterylne M9 i stosując mieszanie. Powtórz ten proces płukania co najmniej raz jeszcze, aż zapach wybielacza stanie się całkowicie niewykrywalny. Aby dokładniej zsynchronizować stadia rozwoju zwierząt, zatrzymaj je w stadium L1, inkubując embriony w medium M9 bez pożywki.

Jest to realizowane poprzez przeniesienie embrionów w pożywce M9 do małej kolby Erlenmeyera. Kolbę należy inkubować z wytrząsaniem przez noc w temperaturze odpowiedniej dla danego szczepu i eksperymentu. W tym czasie zwierzęta wyklują się i następnego dnia zatrzymają w diapauzie L1.

Wznowij wzrost larw z określonego punktu czasowego, przenosząc je na przygotowane bakterie wykazujące ekspresję dwuniciowego RNA. Jest to ten sam dzień, w którym na płytki 24-dołkowe naniesiono bakterie. Rozpocznij od przeniesienia zwierząt w stadium L1 do probówki o pojemności 15 ml i ich odwirowania. Następnie skoncentruj zwierzęta w 0,5–1 ml medium M9 i nanieś 5 µL skoncentrowanych nicieni na płytkę.

Policz liczbę zwierząt na płytce i dostosuj stężenie roztworu nicieni. Tytułowana liczba to 30 osobników na każde od 3 do 10 µL. Na koniec nanieś około 30 osobników w stadium L1 na bakterie w każdej studzience przygotowanej płytki.

W płytce 24-dołkowej liczba zwierząt przekraczająca 30 na dołek może prowadzić do głodowania. Po wyschnięciu plamek, co zajmie kilka minut, zabezpiecz pokrywkę gumką receptorką. Inkubuj zwierzęta w pozycji odwróconej w wymaganej temperaturze i czasie, aby uzyskać zwierzęta na pożądanym etapie rozwoju. Gdy nicienie będą gotowe do przesiewu, potwierdź, że kontrole pozytywna i negatywna wykazują oczekiwane fenotypy. Następnie obserwuj zwierzęta eksperymentalne pod kątem nieprawidłowości rozwojowych.

Następnie, korzystając z mikroskopu stereoskopowego, przymocuj od 8 do 12 osobników z każdej studni do szkiełek Agri PET 4% za pomocą pięciomikrolitrowej kropli środka anestetycznego. Po nałożeniu odpowiedniego szkiełka nakrywkowego, przeprowadź obserwacje co najmniej pięciu osobników przy użyciu mikroskopu świetlnego. Prowadź uporządkowaną bazę danych zawierającą gen, liczbę zaobserwowanych osobników oraz wyniki fenotypowe.

W każdym eksperymencie RNAi należy zweryfikować fenotyp uzyskany w wyniku RNAi za pomocą innego fenotypu wtórnego, jeśli jest to możliwe, a także poprzez powtórzenie eksperymentu; w powtórzeniach można wykorzystać bakterie z tej samej passy. Starsze passy mogą prowadzić do słabego wzrostu w nocnych kulturach płynnych i powinny zostać najpierw ponownie rozrysowane. Niektóre kultury bakteryjne mogą nie rosnąć prawidłowo ze względu na produkt genu ekspresowany w ich plazmidzie.

W takim przypadku należy po prostu skoncentrować bakterie przed wysianiem na płytki. W przypadku prowadzenia ciągłego przesiewu ważne jest, aby zawsze mieć przygotowaną wystarczającą liczbę embrionów do wyznaczenia stadium rozwoju. Szczep przesiewowy powinien być zawsze karmiony, a nie głodzony, oraz wolny od zanieczyszczeń, które mogłyby wpłynąć na badany fenotyp.

Ustaliliśmy harmonogram karmienia zwierząt w celu ich utrzymania. Geny wpływające na lokalizację DBL one zidentyfikowano za pomocą RNAi, wykorzystując szczep zaprojektowany na potrzeby tego przesiewu. Prawidłowa ekspresja znacznika GFP dbl one obejmuje ciała komórek brzusznego sznura nerwowego oraz rząd punktów u zwierząt karmionych antysensownym RA przeciwko DBL.

Jeden z mRNA wykazał silnie osłabioną ekspresję DBL one. Zwierzęta te były również małe, podobnie jak osobniki pozbawione funkcjonalnego DBL L one. Przesiew RNA I pozwolił na skuteczną identyfikację wielu innych genów, których produkty wpływają na lokalizację DBL one, rozszerzając tym samym naszą wiedzę na temat transportu wewnątrzkomórkowego TGF beta i stanowiąc punkt wyjścia dla wielu dalszych badań.

Stosując tę metodę, jedna osoba może w rozsądny sposób przygotować i obserwować od dwóch do czterech serii eksperymentów w każdym tygodniu. Na przykład zwierzęta poddane procedurze w poniedziałek i wtorek mogą być obserwowane odpowiednio w czwartek i piątek, a następnie zwierzęta mogą być ponownie przygotowane w piątek i sobotę na poniedziałek i wtorek. Obserwacja podczas przeprowadzania całej procedury przesiewowej.

Ważne jest, aby zapewnić stałą dostępność embrionów do wyznaczania stadium rozwoju, dlatego należy regularnie utrzymywać linię przesiewową. Ponadto istotne jest sporządzanie szczegółowych notatek ze wszystkich obserwacji.