Szybka i wydajna generacja neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie płyt wielodołkowych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (H PSCs) w neurony z wykorzystaniem formatu płytek wielodawkowych. Cel ten osiąga się poprzez pobranie i wysianie zawiesiny pojedynczych komórek H PSCs do płytek 96-dołkowych z dnem w kształcie litery V, aby w ciągu nocy utworzyły ciała zarodkowe (EBS).

Następnie EBS przenosi się do płytek w kształcie litery U o ultra-niskiej adhezji zawierających pożywkę różnicującą w celu indukcji formowania neuroektodermy. W dalszej kolejności EBS wysiewa się na płytki powlekane matrigelem, aby promować wzrost neuronów. Wyniki uzyskane za pomocą immunofluorescencji około ósmego dnia mogą wykazać obecność typowych markerów neuronalnych.

Protokoły barwienia służące do różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w neurony są często skomplikowane i żmudne. Przez pewien przypadek natrafiliśmy na bardzo prostą procedurę otrzymywania neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Z technicznego punktu widzenia główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod jest to, że jest ona łatwa do przeprowadzenia, szybka i kosztowo efektywna. Jednocześnie procedurę przedstawi dr MI Z z laboratorium. Przygotować pożywkę do formowania ciałek zarodkowych (EB) oraz pożywkę do różnicowania zgodnie z opisem w protokole pisemnym.

Hodować ludzkie PSC w warunkach wolnych od komórek karmionek, np. w pożywce warunkowanej mT, na płytkach powlekanych Matrigel lub z zastosowaniem chemicznie zdefiniowanych systemów hodowli w warunkach aktywnego wzrostu poniżej pełnej konfluencji. Za pomocą stereomikroskopu i sterylnej plastikowej końcówki pipety mechanicznie usunąć spontanicznie zróżnicowane kolonie. Pozostałe niezróżnicowane kolonie przemyć PBS i użyć Accutane zawierającego 1x inhibitor ROCK w celu dysocjacji do pojedynczych komórek.

Odwirować pojedyncze komórki przy 200 G przez dwie minuty, a następnie zawiesić je w niewielkiej objętości pożywki do tworzenia ciałek zarodkowych (EB). Za pomocą komory countingowej (hemocytometru) określić miano komórek. Dodać odpowiednią liczbę komórek do pozostałej pożywki do tworzenia EB, aby uzyskać miano w zakresie od 40 000 do 80 000 komórek na mililitr.

Używając pipety wielokanałowej, przenieś 100 µL na każdą studzienkę płytki 96-dołkowej z okrągłym dnem, tak aby w każdej studzience znalazło się od 4 000 do 8 000 komórek. Wirowarką do płytek z ruchomymi koszyczkami odwiruj płytkę przy 400 G przez jedną minutę, aby zebrać wszystkie komórki na dnie studzienek. Przenieś komórki do inkubatora i pozostaw na noc w celu utworzenia EBS; następnego dnia sprawdź je pod mikroskopem stereoskopowym.

Zebrać EBS i przenieść w niewielkiej objętości do 3,5 cm szalki bakteriologicznej zawierającej 2 ml pożywki różnicującej. Przemyć komórki, delikatnie obracając szalkę. Dodać 100 µl pożywki różnicującej do każdej studni płytki o ultra niskim przywiązaniu (ultra low attachment).

Dół płytki 96-dołkowej pod mikroskopem stereoskopowym. Przenieś EBS w małych objętościach z naczynia do mycia do dołków 96 U. Inkubuj EBS przez cztery dni, aby umożliwić formowanie się neuroektodermy w czwartym dniu.

Przemyj komórki w medium do różnicowania, a następnie wysiej je pojedynczo do dołków płytki wieloformatowej pokrytej matrigelem, np. płytki 12-dołkowej. Komórki powinny być równomiernie rozmieszczone w dołkach, aby umożliwić niezakłócony wzrost neuronów. Pozostaw EBS do luźnego przytwierdzenia się do matrigelu przez około 10 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie ostrożnie przenieś płytkę do inkubatora. W ciągu następnych czterech dni neurony będą wyrastać z wysianych EBS w sposób radialny. Wcześniej wykazaliśmy, że podobnie jak w wielu innych przypadkach, EBS z H PSCs można było wygenerować po prostu poprzez ponowne wysianie agregatów powstałych podczas rutynowego rozdzielania H HPCs do naczyń o niskim przywieraniu.

Zazwyczaj skutkuje to szerokim rozkładem wielkości komórek. Kolejnym problemem jest tendencja ciał embrionalnych (EB) utrzymywanych w zawiesinie do agregowania się, co prowadzi do jeszcze większej heterogeniczności rozmiarów. Aby temu zapobiec, pojedyncze komórki hPSC wysiano do studzienek o niskim przywieraniu, co jednak nie doprowadziło do powstania ciał embrionalnych i spowodowało śmierć komórek. Jednakże połączenie cząsteczki wspomagającej przeżywalność komórek Y 2 7 6 3 2 z alkoholem poliwinylowym, który wykazuje działanie wspomagające formowanie EB z hESC, pozwoliło na powstanie ciał embrionalnych z zawiesin pojedynczych komórek hESC w ciągu nocy.

Wygodnym rozwiązaniem było to, że rozmiary EB w tym wielopotytrowym formacie płytek można ściśle kontrolować poprzez osadzanie różnej liczby komórek w każdej studzience. W przeciwieństwie do stosowania konwencjonalnych technik, po przeniesieniu EB na płytki 96-dołkowe o ultra-niskim przywiązaniu, indukowano tworzenie neuroektodermy przy użyciu koktajlu małych cząsteczek składającego się z inhibitorów F-G-F-E-R-K-T-G, TGF beta SMA two oraz BP SMA one, co następnie pozwoliło na wysianie komórek na matrigelu w celu uzyskania neuronów. Inicjowanie tworzenia EB z około 8 000 komórek zapewniło najlepszą zdolność do różnicowania neuronalnego, która charakteryzuje się wyraźnymi wypustkami neuronalnymi wyrastającymi z wysianych EB.

Zredukowana liczba nekrotycznych centrów EB po wysiewaniu oraz wysoka ekspresja markerów sensorycznych i panneuronalnych, takich jak B rrn three A i beta three tubulin. Ogólna wydajność różnicowania neuronalnego wydaje się być porównywalna z pierwotną procedurą, która do tej pory była stosowalna zarówno w przypadku HSC, jak i HI PSC. Trzy niezależne linie HPSC, w tym komórki HES oraz HIPS, zostały pomyślnie przetestowane w procedurze wielodołkowej, choć ogólnie nie można wykluczyć zmienności zależnej od linii komórkowej oraz różnic w wydajności różnicowania.

Rysunek ten przedstawia rozdzielone pojedyncze komórki neuroektodermalne z czwartego dnia, które zostały wysiane jako pojedyncze komórki i pomyślnie zróżnicowane z wydajnością wynoszącą około 60%. Obsługa EBS na platformie multi titter wymaga początkowo pewnego przeszkolenia, ale po pewnym czasie okaże się, że jest to całkiem proste.