Konwersja testu ELISA typu capture na test Luminex xMAP z wykorzystaniem metody wielipleksowego przesiewania przeciwciał

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest przeniesienie uprzednio zoptymalizowanego testu ELISA dla cytokiny TNF Alpha na platformę Xap przy jednoczesnej ocenie alternatywnych par przeciwciał. Zostaje to osiągnięte poprzez sprzężenie przeciwciała wychwytującego z zestawu ELISA, wraz z trzema innymi kandydackimi przeciwciałami wychwytującymi, z czterema różnymi zestawami mikrosfer lub kulek po ich wymieszaniu. Te cztery zestawy umożliwiają jednoczesne przetestowanie wszystkich czterech kandydatów z czterema oddzielnymi przeciwciałami detekcyjnymi w celu wyłonienia najlepszej pary przeciwciał.

Kolejne dwa testy Xap zostają opracowane z wykorzystaniem dwóch najbardziej optymalnych par przeciwciał. Następnie wydajność tych testów jest porównywana z wydajnością oryginalnego testu EISA pod kątem siły sygnału, zakresu dynamicznego i czułości. Wyniki pokazują, że podobne przeciwciała mogą działać bardzo różnie w tych samych warunkach oraz że kilka przeciwciał można przesiewać jednocześnie za pomocą testu Luminex Xap, co wykazuje, że test ten charakteryzuje się zwiększoną czułością i szerszym zakresem dynamicznym w porównaniu do EISA.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak EIS A, jest to, że immunoanalizy oparte na xap pozwalają badaczowi na testowanie wielu celów lub, jak w tym przypadku, jednoczesne testowanie wielu przeciwciał, aby zidentyfikować przeciwciało o najlepszych parametrach. Procedurę zaprezentuje Erica Lopez, naukowiec współpracujący w Luminex Corporation.

Protokół należy rozpocząć od wyboru i przygotowania czterech przeciwciał wychwytujących oraz czterech przeciwciał detekcyjnych specyficznych dla ludzkiego TNF alpha, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Należy również przygotować jedno przeciwciało potwierdzające specyficzne dla gatunku gospodarza przeciwciał wychwytujących. Odczynniki z zestawu do sprzęgania przeciwciał należy doprowadzić do temperatury pokojowej.

Oznacz cztery probówki reakcyjne numerami obszarów koralików wybranych do reakcji sprzęgania. Przenieś zawartość czterech fiolek mikrosfer mag plex do czterech oznaczonych probówek reakcyjnych. Przemyj każdy z zestawów koralików dwukrotnie w 500 µL buforu aktywacyjnego, a następnie aktywuj każdy zestaw koralików roztworami sulf ONHS i EDC zgodnie z opisem w zestawie do sprzęgania przeciwciał.

Instrukcja obsługi: po 20 minutowej inkubacji na rotatorze powtórz poprzedni etap płukania z obecnie aktywowanymi kuleczkami łącznie trzy razy, używając 500 µL buforu aktywacyjnego. Dla każdego płukania przygotuj cztery oddzielne roztwory o objętości 500 µL, z których każdy zawiera 7,5 µg przeciwciała wychwytującego w buforze inaktywacyjnym.

Dodaj te cztery roztwory przeciwciał wychwytujących do odpowiednich probówek reakcyjnych. Natychmiast wymieszaj każdą probówkę w wirówce typu vortex i inkubuj przez dwie godziny na rotatorze. Powtórz etap płukania obecnie sprzężonych kulek łącznie trzy razy, używając 500 µL buforu do płukania dołączonego do zestawu do sprzęgania przeciwciał.

Po ostatnim etapie płukania, do każdej probówki z reakcją należy dodać 500 µL buforu do płukania, aby uzyskać końcowe stężenie zapasu 5 milionów kulek sprzężonych z przeciwciałami na mL, wymieszać w wirówce typu vortex, a następnie poddać probówki sonikacji w celu rozproszenia kulek. Liczbę kulek odzyskanych po reakcji sprzęgania należy policzyć za pomocą licznika komórek lub hemocytometru. Odzyskiwanie z reakcji sprzęgania zazwyczaj przekracza 90%. Aby potwierdzić pomyślny przebieg reakcji sprzęgania, należy przygotować roztwory testowe zapasów sprzężonych kulek dla każdego zestawu o końcowym stężeniu 100 kulek na µL w buforze do analizy, a następnie przygotować rozcieńczenia przeciwciał FICO znakowanych przeciwko odpowiednim gatunkom.

Przeciwciało potwierdzające IgG w stężeniu 4 µg/mL w buforze do analizy. Nanieś 50 µL każdego roztworu testowego do czterech studzienek okrągłodnnej płytki 96-dołkowej, co łącznie daje 16 studzienek. Następnie dodaj 50 µL buforu do analizy do ośmiu studzienek w celu pomiaru tła oraz 50 µL rozcieńczonego przeciwciała potwierdzającego do ośmiu pozostałych studzienek. Delikatnie wymieszaj reakcje, pipetując w górę i w dół kilka razy za pomocą pipety wielokanałowej.

Przykryć płytkę i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce do płytek. Umieścić płytkę na magnetycznym separatorze do płytek na jedną do dwóch minut, aby wyciągnąć koraliki z roztworu. Następnie usunąć ciecz, gwałtownie odwracając płytkę nad pojemnikiem na odpady, podczas gdy znajduje się ona na separatorze.

Przemyj każdą studzienkę dwukrotnie, dodając 100 µL buforu do analizy, a następnie usuwając SANE z płytki w analogiczny sposób. Używając magnetycznego separatora do płytek, resuspenduj kuleczki w 100 µL buforu do analizy, delikatnie pipetując w górę i w dół pięć razy za pomocą pipety wielokanałowej. Przeprowadź analizę na urządzeniu Luminex xAP, takim jak instrument Magix.

Intensywność sygnału fluorescencyjnego tej reakcji jest wprost proporcjonalna do ilości białka na powierzchni kulek, co umożliwia szybką ocenę względnej ilości białka sprzężonego z kulkami. Aby wyznaczyć najskuteczniejszą parę przeciwciał w teście xap, przygotować początkową mieszaninę wszystkich czterech zestawów kulek, dodając 10 µL każdego z nich do 0,96 mL buforu do testu. Przygotować roztwory przeciwciał detekcyjnych, rozcieńczając każde przeciwciało do stężenia 1 µg/mL w buforze do testu.

Jest to również bufor do analizy. Przygotować standard białka TNF alpha firmy R&D Systems w stężeniu 2000 picograms per milliliter oraz rozcieńczyć Streptawidynę R FICOerynę do stężenia eight micrograms per milliliter. Do każdego z 16 dołków okrągłodنnej płytki 96-dołkowej CoStar przeznaczonej do analizy przesiewowej dodać 50 microliters mieszaniny kulek sprzężonych z przeciwciałem.

Następnie do ośmiu z 16 dołków dodaje się 50 µL buforu do analizy w celu pomiaru tła. Dalej do pozostałych ośmiu dołków pipetuje się 50 µL standardu TNF alpha w celu pomiaru odpowiedzi. Inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem i wytrząsając na wytrząsarce do płytek analitycznych.

Następnie do czterech dołków dodaje się po 50 µL każdego z czterech przeciwciał detekcyjnych, przy czym dwa dołki stanowią kontrolę tła, a dwa pozostałe są dołkami odpowiedzi. Inkubuje się przez 30 minut w tych samych warunkach, a następnie do wszystkich dołków dodaje się 50 µL odczynnika SAPE. Ponownie inkubuje się przez 15 minut w tych samych warunkach.

Umieść płytkę na magnetycznym separatorze płytek na jedną minutę. Następnie usuń ciecz, energicznie odwracając płytkę nad pojemnikiem na odpady, podczas gdy znajduje się ona na separatorze. Pipetuj 100 µL buforu do analizy do każdej z 16 studni.

Następnie usuń ciecz z kulek za pomocą separacji magnetycznej. Dalej, dodaj 100 µL buforu do analizy do każdego z 16 dołków. Odczytaj płytkę za pomocą instrumentu Luminex mag picks, korzystając z instrukcji obsługi w celu zapewnienia prawidłowego działania.

Wybierz parę przeciwciał, która zapewnia pożądaną siłę sygnału. Po wybraniu najlepszego przeciwciała wychwytującego, rozcieńcz 100 µl zapasu kulek sprzężonych z tym przeciwciałem do objętości 10 mL buforem do analizy. Dodaj 50 µL rozcieńczonych kulek do 78 studzienek dwóch płytek 96-dołkowych CoStar z okrągłym dnem.

Każda płytka zostanie wykorzystana do oceny wydajności innego przeciwciała detekcyjnego. Następnie należy przygotować 12-punktową krzywą wzorcową, rozpoczynając od 8 000 pg/mL i kończąc na 4 pg/mL, zgodnie z procedurą firmy R&D Systems.

Standard TNF Alpha: do każdej z płytek dodaj sześć powtórzeń po 50 µL każdego rozcieńczenia oraz sześć studzienek zawierających po 50 µL buforu do analizy jako tło, co daje łącznie 78 studzienek na płytkę. Inkubuj płytki przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem i wytrząsając na wytrząsarce do płytek analitycznych. Następnie do wszystkich 78 studzienek pierwszej płytki dodaj 50 µL pierwszego przeciwciała detekcyjnego.

Powtórz procedurę dla drugiego przeciwciała detekcyjnego na drugiej płytce. Inkubuj płytki przez 30 minut w tych samych warunkach. Następnie dodaj 50 µL odczynnika SAPE do wszystkich dołków każdej płytki.

Po potrząsaniu obiema płytkami przez 15 minut w warunkach ochrony przed światłem, należy umieścić płytki na magnetycznych separatorach płytek na jedną minutę. Usuń ciecz, energicznie odwracając płytkę znajdującą się na separatorze nad pojemnikiem na odpady. Następnie pipetuj 100 µL buforu do testu do każdej z 78 studni na płytkach, zanim ciecz z kulek magnetycznych zostanie usunięta.

Po dodaniu 100 µL buforu do testu do kulek w każdym z 78 dołków na płytkach, przeanalizuj płytki na urządzeniu MagPicks, korzystając z instrukcji obsługi w celu zapewnienia prawidłowego działania. Postępuj zgodnie z instrukcjami dołączonymi do zestawu ELISA Duo TNF-α/TNFSF1a dla ludzi firmy R&D Systems. Zmierz odpowiedź wygenerowaną przez standard dostarczony w zestawie R&D.

Powtórz test ELISA jeszcze trzy razy, zastępując przeciwciała wychwytujące i detekcyjne firmy r and d systems przeciwciałami innych dostawców. Dla uproszczenia sparuj przeciwciała według dostawcy i oceń każdą parę niezależnie, zgodnie z formatem EISA, przy użyciu każdego z trzech standardów białka TNF Alpha. Testy Luminex Xap przeprowadzono w trybie multipleksowym, aby ocenić wszystkie cztery przeciwciała wychwytujące jako mieszaninę poprzez połączenie czterech zestawów przeciwciał TNF alpha sprzężonych z mikrosferami Mag PLX; przeciwciała wychwytujące oceniano indywidualnie z każdym z czterech biotynylowanych przeciwciał detekcyjnych, tak aby interakcję jednego przeciwciała detekcyjnego z każdym z czterech przeciwciał wychwytujących można było określić jednocześnie.

Wyniki wskazały, że para przeciwciał z zestawu DUO firmy R&D Systems wykazała najlepszą wydajność, dając odpowiedź na poziomie 6 183 jednostek średniej intensywności fluorescencji (MFI). Zaobserwowano również, że przeciwciała detekcyjne od Millipore i ABAM zapewniały zadowalającą odpowiedź w teście XAP w połączeniu z przeciwciałem wychwytującym R&D Systems; natomiast przeciwciała wychwytujące od Millipore, ACAM i Novus dawały mniej korzystną odpowiedź w teście XAP. W celu porównania czterech par przeciwciał w formacie EISA zastosowano protokół z zestawu DUO firmy R&D Systems.

W odniesieniu do wszystkich par przeciwciał zastosowano protokół firmy r and d systems, ponieważ odzwierciedla on typowe protokoły EIA powszechnie stosowane obecnie i jest analogiczny do protokołów wykorzystywanych w technologii xap. Testy EISA wykazały, że para przeciwciał z firmy r and d systems ponownie przyniosła najlepsze wyniki. Para przeciwciał z firmy Acam nie wywołała żadnej odpowiedzi, natomiast pary przeciwciał z firm Millipore i Novas wykazały umiarkowane odpowiedzi, co pozwoliło ocenić wszelkie różnice w reaktywności przeciwciał.

W przypadku standardu, wszystkie cztery pary przeciwciał przetestowano z użyciem trzech różnych standardów rekombinowanego białka TNF alpha pochodzących od trzech różnych dostawców. Dane wykazują, że standardy rekombinowanego białka TNF alpha od trzech dostawców dały równoważne wyniki. Białko TNF alpha od r and d systems zostało wykorzystane do wygenerowania krzywych wzorcowych w testach ELSA i XAP.

Podczas gdy test ELI A przeprowadzono z użyciem pary przeciwciał firmy R&D Systems, w testach Xap wykorzystano przeciwciało chwytające firmy R&D Systems oraz przeciwciało detekcyjne pochodzące albo z R&D Systems, albo z Millipore. Białko TNF alpha firmy R&D Systems rozcieńczono tak, aby uzyskać zakres stężeń od 8 000 do zaledwie 4 pg/mL. Para przeciwciał z R&D Systems w teście Xap dała oczekiwany wynik z odpowiedzią przekraczającą 20 000 MFI, jak pokazano.

Gdy w teście Xap zamiast przeciwciała detekcyjnego firmy R&D Systems zastosowano przeciwciało detekcyjne firmy Millipore, odpowiedź wyniosła około 30% odpowiedzi uzyskanej przy użyciu przeciwciała detekcyjnego z R&D Systems. Zielona linia na tym wykresie reprezentuje krzywą wzorcową testu ELISA, dla którego zalecany przez producenta zakres TNF alpha wynosił od 16 do 1000 pg/mL. Ze względu na ograniczenia spektrofotometru nie było możliwe zwiększenie zakresu testu ELISA.

Ponadto zakres dynamiczny i czułość obu metod są lepiej widoczne po przedstawieniu ich w skali logarytmicznej. Wyraźna różnica między nachyleniem krzywej odpowiedzi EISA a odpowiedziami z testów xap wskazuje na bardziej ograniczoną zdolność wykrywania TNF alpha w teście EL iza zarówno przy wyższych, jak i niższych stężeniach. Granice wykrywalności lub LOD dla dwóch funkcjonalnych testów xap TNF alpha zostały przybliżone poprzez zidentyfikowanie najniższego stężenia TNF alpha z poziomem odpowiedzi wyższym niż tło, powiększonym o trzykrotność odchylenia standardowego lub SD z sześciu powtórzeń.

Można zauważyć, że przy zastosowaniu pary od R&D Systems najniższe stężenie TNF alpha wynoszące 3,91 picograms per milliliter wywołało odpowiedź na poziomie 66 MFI, co jest wartością wyższą niż odpowiedź dla tła powiększonego o trzy SD, spełniając tym samym to kryterium. Gdy przeciwciało detekcyjne firmy Millipore zostało użyte wraz z przeciwciałem wychwytującym od R&D Systems, granica wykrywalności była niższa niż 7,81 picograms per milliliter.

W tym przypadku druga najniższa stężenie TNF alpha wygenerowała akceptowalną odpowiedź na poziomie 17 MFI, co było wartością większą niż odpowiedź dla najniższego stężenia TNF alpha powiększona o trzykrotność jego odchylenia standardowego. Podobnie, granicę wykrywalności dla zestawu r and d systems duo set Eliza oszacowano na wartość między 63 a 31 picograms per milliliter. Po wykonaniu tej procedury można przeprowadzić kolejne kroki, takie jak testowanie różnych macierzy próbek lub stężeń przeciwciała w reporterze, w celu dalszej optymalizacji testu xap.