Tworzenie określonych środowisk gazowych w celu badania wpływu hipoksji na C. elegans
20 lipca 2012
Niniejsza praca szczegółowo opisuje sposób wykorzystania komór hipoksji z przepływem ciągłym do generowania atmosfer o określonych stężeniach O2 w celu zrozumienia reakcji biologicznych na obniżone stężenie O2. System ten jest łatwy w konfiguracji i konserwacji oraz wystarczająco elastyczny, aby dostosować go do szerokiego zakresu stężeń O2 oraz różnych systemów modelowych
Celem następnego eksperymentu jest przygotowanie i utrzymanie komory hipoksji z wykorzystaniem metody przepływu ciągłego. Osiąga się to poprzez pozyskanie i wykonanie niezbędnych rurek, kolb i komór do przeprowadzenia procedury. W drugim kroku należy podłączyć butlę z tlenem i dobrać szybkość przepływu, aby uzyskać pożądany poziom hipoksji.
Nawilż gaz, przepuszczając go przez kolbę do bąbelkowania wypełnioną wodą dejonizowaną. Podłącz nawilżony gaz do komory hipoksji i umieść próbki testowe w komorze, aby poddać je warunkom niedotlenienia. Otrzymane wyniki wykazują zależną od Hi F1 letalność zarodkową w warunkach hipoksji na podstawie obserwacji przeżywalności do wieku dorosłego.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak komory rękawicowe, jest łatwość i niski koszt wykonania w warunkach laboratoryjnych, a także zapewnienie dokładnego i powtarzalnego stężenia gazów w komorze środowiskowej. Choć metoda ta pozwala na badanie odpowiedzi na hipoksję u nicienia C. elegance, może ona zostać zaadaptowana do innych układów, w tym większych organizmów modelowych oraz hodowli komórkowych. Dodatkowo może być wykorzystywana do badania innych gazów, w tym dwutlenku węgla i siarkowodoru.
Niniejszy protokół demonstruje sposób budowy komory hipoksycznej. Gaz przechowywany jest w butlach z gazem sprężonym o określonym stężeniu tlenu, do których przymocowany jest dwustopniowy regulator. Gaz wprowadzany jest do dolnej części rurki przepływowej i opuszcza ją górną częścią z odpowiednią prędkością przepływu.
Następnie gaz przepływa do kolby z bąbelkami, gdzie ulega nawilżeniu. Nawilżony gaz przechodzi przez zawór wlotowy do komory hipoksji, narażając próbki na warunki niedotlenienia. Na koniec gaz jest odprowadzany do pomieszczenia przez otwór wylotowy wywiercony w komorze.
Jako obudowę komory środowiskowej można wykorzystać szalkę krystalizacyjną z Pyrexu lub pudełko po opakowaniu typu arrow pack. Objętość pojemnika powinna być ograniczona do minimum, a materiał musi być nieprzepuszczalny dla gazów. W jednej ze ścianek pojemnika należy wywiercić otwór wiertłem węglikowym lub diamentowym, a następnie zamontować w nim plastikowy króciec węża.
Wymieszaj żywicę epoksydową przed nałożeniem jej na pudełko i złączkę. Następnie powtórz tę samą procedurę po przeciwnej stronie pojemnika, przesuwając drugi otwór względem pierwszego. Aby zwiększyć turbulencyjne mieszanie, użyj rurek FEP lub nylonowych o średnicy zewnętrznej 1/8 cala, aby połączyć zbiorniki z gazem sprężonym z urządzeniem do kontroli przepływu, takim jak kontroler masy przepływu lub rotametr.
Zbiorniki z gazem powinny mieć określoną koncentrację tlenu zrównoważoną azotem, zgodnie z certyfikowanym standardem zawartości tlenu lub dla warunków anoksycznych. W przypadku czystego azotu należy zastosować regulator dwustopniowy, z drugim stopniem ustawionym na pożądane ciśnienie. Instrukcje dotyczące wyboru odpowiedniego przepływu znajdują się w protokole pisemnym.
Następnie podłącz przewód z dwustopniowego regulatora do rotametra, który kontroluje szybkość przepływu gazu wprowadzanego do komory. Wyloty rotametra są połączone z butelką do płukania gazu z cylindrem spiekanym, zawierającą wodę destylowaną. Następnie podłącz przewód po drugiej stronie butelki do płukania do jednego z przyłączy komory środowiskowej.
Dzięki temu gaz wnikający do komory środowiskowej zostanie nawilżony. Użyj smaru próżniowego, aby uszczelnić komorę. Następnie umieść obciążniki na pokrywie komory, aby zapewnić szczelność powietrzną.
Sprawdź szczelność, przykładając niewielką ilość wody w dłoni w rękawiczce do przyłącza odpływowego gazu w komorze i sprawdzając, czy nie pojawiają się pęcherzyki powietrza. Najpierw wytwórz zsynchronizowane populacje sea Elgan. Umieść od 1 do 100 dorosłych osobników GR w kropli alkalicznego roztworu wybielacza na powierzchni niezasianej płytki z podłożem do wzrostu nicieni.
Pozostaw roztwór wybielacza w celu wchłonięcia do płytki po okresie inkubacji trwającym co najmniej osiem godzin. Przenieś zsynchronizowane larwy w stadium L1 na płytkę zaszczepioną żywymi bakteriami OP 50. Alternatywnie, pozwól dorosłym osobnikom GRA składać jaja na płytce przez dwie do trzech godzin, aby uzyskać grupę nicieni, które będą rozwijać się synchronicznie, lub wybierz larwy w stadium L4 z mieszanej populacji, aby zebrać młode embriony.
W stadium od dwóch do czterech komórek, za pomocą żyletki, rozdrobnij dorosłe osobniki GR w niewielkiej objętości wody, a następnie przenieś embriony pipetą ustną, po czym umieść nicienie na płytce w celu poddania ich warunkom hipoksji. Wzdłuż krawędzi płytek nanieś pierścień z kwasu palmitynowego w stężeniu 10 mg/mL w etanolu, aby zapobiec ucieczce nicieni z powierzchni płytki agarowej.
Kwas palmitynowy wytrąci się z roztworu. W miarę odparowywania etanolu utworzy się bariera fizyczna zapewniająca jednorodność; przed ekspozycją w komorze środowiskowej należy pamiętać o uzupełnieniu wody w butelce zmywacza gazowego. Po przeniesieniu nicieni na płytki, szczelnie zamknąć płytki w komorze środowiskowej, uruchomić przepływ gazu i utrzymać ekspozycję przez wymagany czas analizy.
Aby ocenić przeżywalność embrionów do wieku dorosłego, należy pozwolić nicieniom rozwijać się przez 48 godzin po powrocie do powietrza o temperaturze pokojowej, po czym powinny one osiągnąć stadium czwartej larwy lub jednodniowych osobników dorosłych; następnie ocenia się przeżywalność do wieku dorosłego. Aby zwizualizować nicienie poddane ekspozycji hipoksyjnej, należy przenieść je do kropli M9 na kwadratowej szkiełku podstawkowym o boku 22 mm i w razie potrzeby odwrócić na podkładkę z 2% agarozy w M9.
Jako środek znieczulający można zastosować 25 millimolar amol lub 10 millimolar azotku sodu. Alternatywnie, po narażeniu na hipoksję, przezroczystą komorę środowiskową można umieścić bezpośrednio na stoliku stereomikroskopu. Przedstawiono dwa widoki, z czego jeden obejmuje cały układ przepływu gazu.
Drugą z samą komorą na stole mikroskopu. Hoduj dwa szczepy Bristol N na czterech 10 centymetrowych płytkach wzrostowych, aż większość nicieni osiągnie stadium dorosłych osobników GR. Przenieś nicienie do probówki stożkowej o pojemności 15 mililitrów z roztworem wybielacza alkalicznego w stosunku jeden do pięciu i inkubuj z rotacją, aż nicienie zaczną się rozpuszczać.
Nie dłużej niż pięć minut. Przemyć nicienie trzykrotnie w buforze M9, wirując przy 1 500 ×g między każdym płukaniem, nie zdejmując płyty z wirówki. Przenieś wybielone embriony na 8 płytek NGM o średnicy 150 mm i pozwól embrionom rozwijać się do stadium larw L4 przez około 48 godzin.
W temperaturze 22 °C przenieś płytki do komory środowiskowej i wystaw je na warunki hipoksyczne lub anoksyczne przez cztery godziny lub przez czas określony w projekcie eksperymentalnym. Aby zebrać próbki, szybko zdejmij pokrywę komory hipoksycznej. Pobierz jedną płytkę z próbkami i ponownie zamknij komorę, odnotowując czas i poszczególne kroki.
Po usunięciu nicieni z warunków hipoksji cały ten proces powinien zająć mniej niż dwie minuty. Należy użyć wody destylowanej, aby przelać nicienie na filtr nylonowy, a następnie przelać je do oznakowanej probówki stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej 100 µL 1% SDS. Nicienie w SDS należy wirować w wirówce stołowej z siłą 1 500 ×g przez 15 do 20 sekund.
Po przerwie należy użyć pompy próżniowej, aby usunąć większość nadsączu z probówki, nie naruszając osadu z nicponiami. Za pomocą pipety przenieś osad z nicponiami wraz z określoną objętością cieczy do oznakowanej probówki typu microcentrifuge o pojemności 1,5 µL. Jeśli próbka ma zostać poddana elektroforezie SDS-PAGE, probówka ta może zawierać taką samą objętość dwukrotnego barwnika do ładowania białek; należy zamknąć probówkę i zanurzyć ją w ciekłym azocie.
Powtarzać do momentu wyizolowania wszystkich próbek. W celu zapewnienia spójności należy postępować zgodnie z tymi procedurami również w przypadku próbek kontrolnych powietrza w pomieszczeniu; próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C. Rysunek ten przedstawia żywotność embrionów eksponowanych na 1000 ppm tlenu, 5 000 ppm tlenu oraz normoksję, wynoszącą około 210 000 ppm tlenu.
Zarodki poddaje się działaniu każdego z warunków przez 24 godziny w komorach tlenowych z ciągłym przepływem. Nicienie przeniesiono do warunków normoksji, gdzie rozwijały się do stadium dorosłego przez 48 godzin, a następnie oceniono ich przeżywalność do wieku dorosłego. Po zastosowaniu tej procedury można pobrać próbki do dalszych analiz metodą Western blot, qPCR lub testów fizjologicznych, takich jak pomiar długości życia lub produkcji potomstwa.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo wiedzieć, jak skonfigurować komorę hipoksji z ciągłym przepływem we własnym laboratorium.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszej pracy szczegółowo opisano sposób konfiguracji i konserwacji komory hipoksji z wykorzystaniem metody przepływu ciągłego w celu uzyskania określonych stężeń O2. System został zaprojektowany tak, aby był łatwy w obsłudze i możliwy do dostosowania do różnych eksperymentów biologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Badania nad hipoksją
Wprowadzenie
- Zrozumienie reakcji biologicznych na niski poziom tlenu jest kluczowe.
- Komory hipoksyjne umożliwiają kontrolowane badania nad niedotlenieniem.
- Metody przepływu ciągłego zwiększają wiarygodność warunków hipoksji.
- Poprzednie badania wykazały zróżnicowany wpływ hipoksji na różne organizmy.
Cel badania
- Ustanowienie niezawodnej metody generowania warunków hipoksji.
- Zbadanie wpływu hipoksji na próbki biologiczne.
- Zaprezentowanie elastyczności systemu w odniesieniu do różnych konfiguracji eksperymentalnych.
Zastosowane Metody
- Przygotowanie rurek, kolb i komór do zestawu do hipoksji.
- Podłączenie butli z tlenem w celu kontroli szybkości przepływu.
- Nawilżanie gazu w kolbie z bąbelkami wypełnionej wodą dejonizowaną.
- Umieszczenie próbek testowych w komorze hipoksji w celu ekspozycji.
Główne wyniki
- Wykazano zdolność systemu do tworzenia specyficznych warunków hipoksji.
- Zaobserwowano zależną od Hi F1 letalność zarodkową w środowiskach hipoksycznych.
- Wyniki wskazały na zróżnicowaną przeżywalność do wieku dorosłego w warunkach stresu hipoksycznego.
- Potwierdzono skuteczność komory hipoksji z przepływem ciągłym.
Wnioski
- Komora hipoksji z ciągłym przepływem jest wszechstronnym narzędziem w badaniach biologicznych.
- Umożliwia ona precyzyjną kontrolę poziomu tlenu w warunkach eksperymentalnych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia wpływu hipoksji na rozwój.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ustanowienie precyzyjnych i powtarzalnych warunków hipoksji jest kluczowe dla zmniejszenia ryzyka podczas walidacji celu w modelach chorobowych, w których napięcie tlenowe wpływa na aktywność szlaków sygnałowych. Metoda ta umożliwia skalowalne i niskokosztowe generowanie zdefiniowanych środowisk O2 w celu wsparcia przesiewów mechanistycznych oraz analiz fenotypowych w systemach genetycznie podatnych na manipulacje. Poprzez ograniczenie zmienności ekspozycji na hipoksję, metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w wczesnych etapach procesów odkrywania leków ukierunkowanych na szlaki reagujące na hipoksję.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie odpowiedzi transkrypcyjnych zależnych od HIF-1 przy kontrolowanych stężeniach O2 w celu walidacji celów wrażliwych na hipoksję.
- Wartość operacyjna: Wspiera szybkie pobieranie próbek po ekspozycji na hipoksję, aby uchwycić przejściowe zmiany w sygnalizacji przed ich odwróceniem.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia ilościowe, powtarzalne warunki z określonym poziomem O2 do przesiewania związków modulujących szlaki odpowiedzi na hipoksję.
- Wartość operacyjna: Przezroczystość komory umożliwia wizualizację odpowiedzi fenotypowych w czasie rzeczywistym podczas ekspozycji na gaz.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Umożliwia modelowanie zależności dawka-odpowiedź dla poziomów O2 w celu zmapowania efektów zależnych od stężenia w rozwoju i przeżywalności.
- Wartość operacyjna: Możliwość adaptacji do innych systemów modelowych i gazów (np. CO2, H2S) w celu szerszego modelowania patofizjologicznego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu badawczego – od testowania hipotez dotyczących celów molekularnych po walidację testu, w szczególności w odniesieniu do szlaków modulowanych przez dostępność tlenu.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia precyzyjną kontrolę O2 w celu wyizolowania efektów zależnych od HIF-1 w badaniach walidacji genetycznej.
- Screening: Generuje stabilne, zrównoważone warunki hipoksji, odpowiednie do wysokowydajnego screeningu związków o wysokiej powtarzalności.
- Analityka: Wspiera późniejsze analizy żywotności, transkrypcji lub ekspresji białek po określonych interwałach hipoksji.
- Badania translacyjne: Łączy stężenie O2 z wynikami fenotypowymi istotnymi dla niedokrwienia, mikrośrodowiska guza lub zaburzeń rozwojowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Modułowa konstrukcja pozwala na adaptację w różnych laboratoriach i systemach modelowych bez konieczności ponownej walidacji podstawowych zasad dostarczania gazu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez umożliwienie precyzyjnych eksperymentów z miareczkowaniem O2 w modelach podatnych genetycznie.
- Wartość operacyjna: Niskokosztowa, łatwa w wykonaniu konfiguracja zwiększa dostępność i standaryzację pomiędzy grupami badawczymi.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) dzięki dostarczeniu wiarygodnych danych na temat modulacji celu przy patofizjologicznie istotnych poziomach O2.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów celujących w hipoksję z uwzględnieniem ryzyka poprzez powtarzalne odczyty fenotypowe.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga podstawowej wiedzy z zakresu obsługi gazów oraz dostępu do butli ze sprężonym O2/N2 o certyfikowanych stężeniach.
- Zależne od oprzyrządowania do kontroli przepływu (np. kontrolerów przepływu masowego) oraz materiałów do budowy szczelnych komór.
- Wymaga standaryzowanych procedur SOP w zakresie uszczelniania komory, nawilżania gazu i wprowadzania próbek w celu zapewnienia powtarzalności.
- Należy uwzględnić specyficzne dla danego modelu zakresy tolerancji na O2 podczas przenoszenia metody między gatunkami lub typami komórek.
- Ograniczone przez objętość komory i dynamikę przepływu, co może wpływać na czas równoważenia w formatach wysokoprzepustowych.
