Generowanie, oczyszczanie i charakterystyka inwazyjnych komórkowo form białka DISC1

Ogólnym celem następujących procedur jest uzyskanie oczyszczonych dysków. Po pierwsze, należy uzyskać agregaty zdolne do inwazji w komórki biorcy. Pierwsza metoda zaprezentuje dwa różne sposoby osiągnięcia tego celu.

Fuzja białka fluorescencyjnego tworzącego somy disc one jest nadekspresyjna w ludzkich komórkach neuroblastoma donorowych NLF. Następnie komórki są przemywane PBS, zbierane i lizowane bez użycia detergentów. DNA jest trawione, a agrozony są oczyszczane przy użyciu systemu gradientu sacharozy.

Agrios oczyszczone tą metodą wykazują niską wydajność inwazji komórkowej. Alternatywnym podejściem jest nadekspresja aminokwasów 5 98 do 7 85 rekombinowanego białka disc one w e coli. Fragment białka jest następnie znakowany DITE 5 94, dializowany i oczyszczany przy użyciu macierzy NI NTA, która usuwa wszelkie pozostałe niezwiązane barwniki oraz multimery disc.

Fragmenty otrzymane tą metodą wykazują wysoką wydajność inwazji komórkowej, co pozwala na ocenę inwazji komórek gospodarza. Można wykorzystać oczyszczony fluorescencyjny dysk białkowy, rybosomy lub znakowany dysk rekombinowany. Fragmenty inkubuje się z wybranymi komórkami biorczymi.

Następnie dodaje się błękit Trian, aby wygasić fluorescencję zewnątrzkomórkową, a inwazję wizualizuje się za pomocą mikroskopii konfokalnej. Do tej pory agregacja białek nie była uznawana za cechę przewlekłych chorób psychicznych, takich jak schizofrenia. W przypadku zaburzeń w schizofrenii, gdzie jednym z kandydatów jest określone białko, inwazyjność komórkowa agregatów białkowych stanowi charakterystyczną cechę chorób konformacyjnych białek.

W niniejszej pracy wykazujemy za pomocą dwóch metod, że agregaty białka disc one są inwazyjne dla komórek, a co za tym idzie, że zaburzenia związane z disc one lub neuropatie disc one są zaburzeniami konformacyjnymi białek. Dwie zastosowane metody to po pierwsze oczyszczanie pełnowymiarowego białka disc one ASOS z linii komórkowych neuroblastomy, a po drugie ekspresja C-terminalnego multimerycznego fragmentu białka disc one w e coli, a następnie jego oczyszczanie i znakowanie barwnikiem fluorescencyjnym.

Podczas gdy pierwsza metoda prowadzi jedynie do niskiej wydajności inwazji komórkowej, w której tylko około 0,3% komórek pobiera oczyszczone mikrosomy, czysty fragment białka rekombinowanego infekuje do 20% wystawionych komórek. Opisane tutaj metody powinny być możliwe do przeniesienia na inne białka, w przypadku których przekonująco wykazano formowanie akrosomu lub montaż multimeryczny. W każdej z szalek o średnicy 10 cm.

Wysiej 1,5 × 10⁶ komórek neuroblastoma człowieka oraz komórek LF w uzupełnionej pożywce RPMI 1640 i inkubuj przez noc. Następnego dnia komórki powinny osiągnąć 70–80% konfluencji. Oznacz pięć naczyń do transfekcji plazmidem PC DNA 3.1 MRFP oraz ludzkim pełnowymiarowym DISC1 z etykietą EGFP i pięć naczyń do transfekcji samym plazmidem EGFP. Dla każdego naczynia o średnicy 10 cm połącz 15 µg DNA plazmidowego, 30 µl Metfectiny oraz 750 µl.

Opti MEM w probówce do mikrowirówki wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Następnie w celu transfekcji komórek, dodać kroplami do komórek roztwór odczynnika do transfekcji DNA i inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO 2. 48 godzin po transfekcji monitorowano ekspresję pełnowymiarowego mRFP disc 1 i potwierdzono tworzenie się aggresomów pod mikroskopem fluorescencyjnym. Niektóre komórki zawierają masywne inkluzje białek fluorescencyjnych, jak pokazano tutaj.

Niniejszy protokół łączy metodę oczyszczania ciał Lewy z tkanki mózgowej z protokołem izolacji większych agregatów lub stref agro; ponieważ istniejące metody opierają się na zastosowaniu detergentów, izolacja białek wolnych od detergentów jest kluczowa dla zastosowań w testach inwazyjności komórkowej. Następnie należy odessać medium, przemyć PBS i dodać 400 µL PBS zawierającego koktajl inhibitorów proteaz. Następnie należy zebrać komórki za pomocą skrobaka i przenieść 1 mL zawiesiny komórkowej oraz 10 kulek ceramicznych do probówki do lizy o pojemności 2 mL.

Przeprowadź lizę komórek, stosując trzy impulsy w homogenizatorze pre-cell lyse 24. Siła mechaniczna tego procesu może podnieść temperaturę próbki powyżej 37 °C, dlatego należy zadbać o chłodzenie próbki w lodzie. Po procedurze lizy i schłodzeniu komórek w lodzie, dodaj 10 mM chlorku magnezu oraz 40 j./ml DNAazy i inkubuj przez 60 minut w temperaturze 37 °C przy jednoczesnym wytrząsaniu.

Przygotuj po 10 ml roztworów sacharozy w PBS o stężeniach 80%, 50% i 20% (masowych w objętości). Następnie w stożkowej probówce o pojemności 15 ml przygotuj gradient sacharozy, zaczynając od dwóch ml 80% sacharozy, a następnie dodając dwa ml 50% i dwa ml 20% sacharozy. Wlewaj gradient powoli, uważając, aby nie zmieszać już naniesionych warstw.

Następnie nanieś strawiony lizat na wierzch gradientu i wiruj przez 15 minut przy 1000 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zatrzymaniu wirowania ostrożnie pobierz pipetą interfejs między warstwą 50 a 80% sacharozy, przenieś do 15 ml stożkowej probówki i wymieszaj z pięciokrotnością objętości buforu, a następnie wiruj przez 15 minut przy 1000 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie usuń nadsącz i zachowaj osad zawierający strefę agregacji.

Powtórz płukanie jeszcze dwa razy w tym interfejsie. Strefy Agri są fluorescencyjne i można je zwizualizować pod mikroskopem w świetle UV po ostatnim płukaniu; odlej nadsącz i resuspenduj osad w 250 do 500 µL PBS. Osad ten zawiera oczyszczone strefy agro.

Do każdej studzienki płytki 24-dołkowej zawierającej ludzkie komórki neuroblastoma SH-SY5Y, konstytutywnie wykazujące ekspresję rozpuszczalnego GFP-disc1 C-końca na sterylnych szkiełkach podstawkowych, dodać 10 µL zawiesiny MRFP-disc1-some. Inkubować przez 48 do 72 godzin. Po inkubacji komórki przemyć trzy razy PBS i wygasić fluorescencję zewnątrzkomórkową za pomocą 0,04% trypan błękitu przez pięć minut.

Następnie przemyć próbkę roztworem PBS, aby usunąć błękit trypanowy. Następnie umieścić szalkę na lodzie i dodać 4% PFA oraz PBS na 10 minut w celu utrwalenia komórek. Potem przemyć raz sterylną wodą i zamontować szkiełka nakrywkowe na szkiełkach przedmiotowych, używając medium montażowego Prolong Gold z DPI.

Potwierdź pobieranie w procesie inwazji egzogennych agregosomów poprzez kolokalizację z rekrutowanymi białkami ekspresjonowanymi przez komórki biorcy w obrazach Z-stack. Ten Z-stack obejmuje głębokość około 6 µm.

24 obrazy wykonane w odstępach 200 nanometrów. Fluorescencja strefy agri białka mRFP disc one, pokazana na czerwono, rekrutuje cytozolowy terminalny dysk GFPC. Jeden fragment pokazany na zielono wykazuje kolokalizację w postaci koloru żółtego, co wskazuje, że strefy agri wniknęły do cytozolu biorcy i zrekrutowały wcześniej rozpuszczalne białko disc one.

W tej części protokołu ludzki disc one zostanie znakowany DITE 5 94. Pozwala to na bezpośrednie monitorowanie białka rekombinowanego bez konieczności stosowania dodatkowego barwienia immunologicznego. Należy rozpocząć od usunięcia β-merkaptoetanolu z białka przygotowanego zgodnie z opisem w towarzyszącym dokumencie poprzez trzykrotną dializę w dwóch litrach PBS przy rozcieńczeniu 1:2000.

Następnie w jednej probówce z etykietą „1 mg” rozpuścić 1 mg/mL białka w PBS i dodać 5 mM TCEP, aby odzyskać wolne grupy SH. Do mieszaniny reakcyjnej dodać 20 µL barwnika rozpuszczonego w DMF i inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Korzystając z kasety do dializy SLI o progu odcięcia masy cząsteczkowej 10 000 Da, dializować białko trzykrotnie w PBS w stosunku 1:2000 przez dwie godziny podczas każdego etapu, aby dalej zwiększyć czystość znakowanego białka.

Przeprowadza się oczyszczanie powinowactwa z wykorzystaniem znacznika histydynowego na kolumnie Ni-NTA. Jeden mililitr matrycy Ni-NTA przemywa się 10 mililitrami PBS, a następnie nanosi na kolumnę dializowane białko z etykietą i pozwala mu spłynąć przez złoże.

Roztwór będzie powoli tracić część niebieskiego zabarwienia w wyniku wiązania białka z macierzą NTA; niezwiązany wolny barwnik pozostanie w frakcji przepływowej. Po wprowadzeniu roztworu białka do kolumny, należy przemyć ją trzykrotnie 20 ml PBS. Aby eluować białko, należy dodać do kolumny 2 ml PBS zawierającego 500 mM imidazolu.

Ustaw zawór na niską prędkość i eluuj kroplowo, monitorując kolorowy prążek na kolumnie Ni-NTA. Eluowana kolorowa frakcja zawiera znakowane białko rekombinowane. Przenieś eluat do kasety dializacyjnej typu SLI i przeprowadź dializę eluatu trzykrotnie przeciwko 10 mM NAPI przy rozcieńczeniu 1:2000, przez dwie godziny każdorazowo w 2 litrach. Po dializie przepuść eluat przez sterylny filtr strzykawkowy 0,45 µm, a następnie podziel go na pięć próbek po 100 µL i zamroź gwałtownie w ciekłym azocie.

Całkowita ilość białka powinna wynosić od 0,5 do 1 µg/mL w każdej 100 µL alikwocie. Aby ocenić inwazyjność białka, należy dodać do każdej studni płytki 24-dołkowej zawierającej biorcze ludzkie komórki neuroblastoma SH SY 5Y podłoże zawierające od 5 do 10 µg/mL znakowanego rekombinowanego białka disc one. Komórki stale eksponujące rozpuszczalny znacznik GFP na C-końcu disc one na sterylnych szkiełkach podstawkowych należy inkubować przez 48 do 72 godzin.

Wygaszamy fluorescencję zewnątrzkomórkową, utrwalamy i montujemy komórki w taki sam sposób, jak w przypadku komórek traktowanych strefą agri, a następnie potwierdzamy inwazję egzogennie zastosowanego białka rekombinowanego za pomocą obrazowania Z-stack. Gdy znakowane białko zostanie pobrane, jest ono wykrywane w obrębie obrysu komórek biorców na obrazach generowanych przez mikroskopię konfokalną. Ten Z-stack obejmuje głębokość około 5 µm przy 24 krokach co 220 nm.

Tutaj rekombinowany fragment białka disc1 od aminokwasu 598 do 785, zaznaczony na czerwono, jest pobierany przez komórki biorcy wykazujące ekspresję rozpuszczalnego białka disc1 z tagiem GFP na C-końcu, zaznaczonego na zielono, w celu określenia inwazyjności agregatów białka disc1. Akrozomy składające się z pełnowymiarowego białka disc1 z tagiem mRFP zostały oczyszczone z komórek NLF i naniesione na komórki biorcy SH-SY5Y, zgodnie z opisem w tym materiale, jak pokazano tutaj. Akrozom disc1 z tagiem mRFP zainwadował ludzką komórkę neuroblastoma SH-SY5Y wykazującą ekspresję rozpuszczalnego białka disc1 z tagiem GFP na C-końcu.

Ponadto, asome białka disc one znakowane MRFP było w stanie rekrutować rozpuszczalne białko disc one znakowane GFP do nierozpuszczalnych agregatów. Aby określić inwazyjność, rekombinowane białko disc one znakowane DIA light zastosowano do komórek neuroblastoma SH SY five Y wykazujących ekspresję rozpuszczalnego białka GFP disc one, jak pokazano tutaj. Rekombinowane białko disc one malters, zaznaczone na czerwono, wniknęło do komórki biorcy; żółte kropki wskazują rekrutację rozpuszczalnego białka disc one z końcem C-terminalnym znakowanego GFP do agregatów. Rekombinowane białko disc one, wyekspresowane i oczyszczone z E. coli, wykazało również inwazyjność komórkową w stosunku do neuronów in vivo, gdy białko multimeryczne zostało wstrzyknięte stereotaktycznie do przyśrodkowej kory przedczołowej szczura. Obrazowanie Z-stack potwierdza obecność rekombinowanego białka disc one w neuronach kory szczura, barwionych przeciwciałem przeciwko jądrom neuronalnym.

Przedstawiliśmy właśnie dwie metody generowania agregatów białka disc one do badania inwazji komórkowej. Stosując dowolną z tych metod, możemy badać efekty komórkowe związane z pobieraniem agregatów disc one, eliminując potencjalnie zakłócające zmienne wynikające z ekspresji genów rekombinowanych poprzez transfekcję obcego DNA. Techniki te mogą zostać zastosowane do badania biologicznych efektów patologii białka disc one in vitro w komórkach oraz in vivo poprzez inokulację wewnątrzczaszkową lub inne formy podania w modelach zwierzęcych.

Jesteśmy przekonani, że techniki te mogą zostać przeniesione na inne agregaty białkowe, po wprowadzeniu niewielkich modyfikacji w protokole dostosowanym do każdego konkretnego białka. Przeprowadzając tę procedurę, należy poświęcić wystarczająco dużo czasu na rzetelną analizę obrazów z mikroskopii konfokalnej.