Wizualizacja odpowiedzi indukowanych przez toksyny bakteryjne przy użyciu fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

Celem niniejszej procedury jest wizualizacja odpowiedzi komórek odpornościowych na toksyny bakteryjne. Najpierw toksyna jest eksprymowana i oczyszczana z komórek BL 21 gold. Po potwierdzeniu aktywności i stężenia toksyny, zostaje ona dostarczona do komórek odpornościowych.

Wykonano mikroiniekcję oraz szybką mikroskopię żywych komórek. Analiza uzyskanych obrazów ujawnia kinetykę odpowiedzi komórek odpornościowych na toksynę w czasie rzeczywistym. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny immunologii, takie jak mechanizm aktywacji inflamasomu.

Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat odpowiedzi komórek odpornościowych indukowanej przez toksyny, można ją zastosować również do innych bodźców, w tym do czynników chemotaktycznych. Pomysł na tę metodę pojawił się podczas badania oddziaływań bakterii z hodowanymi komórkami odpornościowymi, kiedy zaobserwowano bardzo zróżnicowane interakcje między bakteriami a komórkami odpornościowymi. Oczyszczanie streptolizyny O lub SLO należy rozpocząć od namnożenia kultury komórek BL 21 gold zawierających pAG3 SLO.

Hodować plazmid do gęstości optycznej OD wynoszącej około 0,6. Aby indukować ekspresję białka, dodać do hodowli pięć mililitrów 20% OSes i inkubować na wytrząsarce przy 225 RPM w temperaturze pokojowej przez trzy godziny. Następnie przenieść bakterie do 500 mililitrowej butelki do wirowania.

Następnie wirować kulturę z prędkością 12 000 ×g przez 12 minut w temperaturze 4 °C, a po wirowaniu odlać nadosad. Osad przechowywać w temperaturze -80 °C przez noc lub dłużej, jeśli jest to konieczne. Aby oczyścić wyekspresowane SLO, do zamrożonego osadu dodać 10 ml buforu do przemywania ly, uzupełnionego o Triton X 100, lizozym i fenylometylosulforyl fluoride, a następnie pipetować w górę i w dół przez około 15 minut.

Aby resuspendować osad, zawiesić go, utrzymując próbkę w lodzie. Przenieść resuspendowany osad do 50 mililitrowej okrągłodennej probówki polipropylenowej typu Oak Ridge. Poddać lizat sonikacji za pomocą sonikatora probe, stosując 40% mocy, pięć razy po 30 sekund w odstępach 30-sekundowych, z 30-sekundowymi przerwami w lodzie pomiędzy cyklami.

Następnie wiruj lizat poddany sonikacji z prędkością 39 000 ×g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu dodaj nadfiltr bakteryjny do 1 ml wypłukanych kulek niklowych NTA. Inkubuj kulki niklowe NTA wraz z lizatem przez 2,5 godziny w temperaturze 4 °C przy łagodnym wstrząsaniu. Po inkubacji.

Odwirować kulec z kulek, wirując z prędkością 400 ×g przez pięć minut w temperaturze 4°C. Należy pamiętać, że wszystkie kolejne etapy płukania i elucji są przeprowadzane przy tych parametrach wirowania, chyba że zaznaczono inaczej. Po wirowaniu.

Połącz 30 µL supernatantu z 10 µL 4x buforu do próbek SDS w probówce do mikrocentryfugi i przechowuj na lodzie do analizy czystości. Następnie odrzuć pozostałą część supernatantu i przemyj kulki cztery razy w buforze do płukania, a następnie raz w buforze solnym, centryfugując po każdym myciu. Od tego momentu należy przez cały czas przechowywać próbkę na lodzie.

SLO jest białkiem bardzo wrażliwym na utlenianie i szybko traci swoją aktywność po ogrzaniu do 37 °C, nawet w krótkim czasie. Aby eluować białko SLO, należy dodać do kulek 1 mL buforu do elucji oraz 5 µL 1 M DTT, a następnie inkubować na lodzie przez 10 minut. Następnie należy odwirować próbkę i zebrać nadsącz do probówki wirówkowej oznaczonej numerem elucji.

Powtórz ten proces trzy razy, a następnie, aby usunąć endotoksyny z białka SLO, dodaj do próbki 200 µL wypłukanych kulek agro-beads conjugated poly mixing zawieszonych w buforze res salt i inkubuj przy wytrząsaniu w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Następnie odwiruj próbkę przy 10 000 ×g przez jedną minutę w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu zbierz nadsącz do nowych, oznakowanych probówek do mikrowirowania.

Połączyć 30 µL każdego eluatu z 10 µL czterokrotnego buforu do próbek SDS. W przypadku analizy metodą SDS-PAGE roztwory SLO należy przechowywać w lodzie. Po oznaczeniu stężenia białek i aktywności hemolitycznej, jeśli wyniki są zadowalające, podzielić SLOE na aliquoty od 5 do 10 µL, a następnie zamrozić na suchem lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

Następnie należy wyznaczyć lizę specyficzną. Reese. Zawiesić badane komórki w dwukrotnym stężeniu. Odwirować sześć milionów komórek na mililitr w buforze RB z 20 µg/ml.

Jodek propidyny. W tym przypadku testowane są komórki T 27 A. Do każdej studzienki płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V dodaj 100 µL komórek z osobnych probówek do mikrocentryfugi.

Przygotuj rozcieńczenia seryjne SLO do stężenia dwukrotnego w stosunku do stężenia końcowego w buforze RB. Następnie dodaj do komórek 100 µL toksyny lub 100 µL buforu RB i inkubuj przez pięć minut w temperaturze 37 °C. Typowe stężenia końcowe mieszczą się w zakresie od 2000 jednostek/mL do 31,25 jednostek/mL.

Analizę komórek należy przeprowadzić na cytometrze przepływowym, zbierając dane z wykorzystaniem filtrów dla fi, cethrin lub pe. Przesunięcie o jedną logarytmiczną jednostkę oznacza komórki przejściowo przepuszczalne, natomiast przesunięcie o trzy jednostki logarytmiczne wskazuje na komórki martwe. Specyficzną lizę komórek należy obliczyć, odejmując procent martwych komórek w próbie kontrolnej od wartości uzyskanej w próbie badawczej, stosując przedstawione tutaj równanie; na jeden dzień przed eksperymentem należy wysiać makrofagi z linii RAW 264.7 na szkło pokryte kolagenem.

Szalki 35 milimetrów z płaskim dnem. Mikroskop wykorzystywany do dostarczania toksyny powinien być wyposażony w odwrócony stolik, stolik grzewczy, odpowiednie kostki filtrów wzbudzania i emisji oraz, jeśli są dostępne, soczewkę Bertranda. Najtrudniejszym elementem tej procedury jest nieuszkodzone wprowadzenie igły do komórek.

Aby zapewnić sukces, używamy soczewki Bertranda, która zazwyczaj służy doyustawiania, aby wizualizować igłę podczas wprowadzania jej przez płaszczyzny ogniskowe. Mikroskop powinien być podłączony do mikroinjektora i sterowany komputerem z wystarczającą pamięcią do zbierania i przechowywania danych; należy włączyć mikroskop oraz mikroinjektor i odczekać, aż podgrzewany stoлик osiągnie temperaturę 37 °C. Przez 30 minut należy znakować komórki barwnikiem w temperaturze 37 °C.

W zależności od analizy znakowanie można przeprowadzić z użyciem 5 µL, 4 lub 2 µL w 1 mL HBSS lub 2 µL wapnia w 1 mL pełnej pożywki; tutaj zastosowano 4 lub 2 µL. Należy usunąć pożywkę komórkową i raz wypłukać komórki za pomocą PBS. Po odessaniu PBS należy zastąpić go 1 mL pożywki RPMI uzupełnionej o 2 mM chlorku wapnia.

Umieść szalkę na mikroskopie, ustaw ostrość na komórkach w świetle przechodzącym, a następnie skoryguj ostrość tak, aby znajdowała się nieco powyżej komórek. Następnie połącz 1 µL toksyny SLO, 4 µL DEXTRA 5 55 (10 mg/mL) oraz 6 µL wody. Następnie odwiruj próbkę z prędkością 20 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.

Dekstran jest stosowany w celu sprawdzenia, czy końcówka femto nie jest zapchana. Za pomocą mikrolodera należy wprowadzić 2 µL rozcieńczonej toksyny do końcówki femto od strony tylnej. Następnie należy zamocować końcówkę femto w mikroinjektorze.

Następnie dostosuj kąt nachylenia wtryskiwacza tak, aby jego końcówka znajdowała się nad środkiem komórek, z zachowaniem miejsca na ruch we wszystkich kierunkach; wyczyść poprzednie ustawienia limitu Z, który ogranicza głębokość wniknięcia końcówki mikro-wtryskiwacza. Ustaw mikro-wtryskiwacz tak, aby wstrzykiwał przez 0,5 sekundy przy ciśnieniu 120 PSI i ciśnieniu wstecznym 20 PSI. Następnie opuść końcówkę, aż znajdzie się w medium.

Używając soczewki Bertranda, wycentruj końcówkę i śledź ją podczas obniżania w kierunku komórek. Gdy igła przestanie być w ostrości, powróć do standardowej optyki.

Cień igły powinien być widoczny w polu widzenia. Ustaw ostrość powyżej komórek i obniżaj igłę, aż stanie się ona ostra. Następnie ustaw ostrość na komórkach i ostrożnie zbliż igłę do jednej z komórek.

Po ustawieniu limitu Z dla iniekcji, rozpocznij obrazowanie i wstrzyknij toksynę. Następnie podnieś igłę i przenieś się do nowego obszaru komórek. Wstrzyknij dodatkową dawkę toksyny i kontynuuj obrazowanie po iniekcji.

Przesuń igłę do pozycji początkowej, aby zapobiec niepożądanemu wyciekowi toksyny z igły, stosując metodę opisaną w tym filmie, 10⁷ do 10⁸ jednostek na mililitr. SLO uzyskuje się zazwyczaj przy stężeniu białka wynoszącym 4 mg/mL. Ten żel SDS-PAGE przedstawia próbki bakteryjne przed i po indukcji toksyny oraz po oczyszczaniu, dla każdej z trzech frakcji elucyjnych; barwienie Coomassie Blue wykazuje, że indukowane SLO zostało pomyślnie oczyszczone.

SLO to prążek o masie 69 kilodaltonów; wykorzystano go do określenia ilości toksyny wymaganej do lizy komórek T 27 A lub D two. Komórki poddano działaniu różnych stężeń SLO przez pięć minut w temperaturze 37°C w obecności jodku propidyny, a następnie analizowano je za pomocą cytometrii przepływowej. Specyficzną lizę określono w sposób przedstawiony tutaj.

250 jednostek na mililitr. SLO powoduje 50% lizy zarówno komórek T 27 A, jak i D two. Sublityczna dawka toksyny powodująca 10% lizy wynosiłaby 62,5 jednostek na mililitr.

Wartości te są istotne dla punktu odniesienia aktywności toksyny w celu oceny śmierci komórek po ekspozycji na toksynę. Ludzkie fibroblasty skórne inkubowano z wapniem i homodimerem aterium, używając zestawu live dead firmy Life Technologies. Po lokalnej ekspozycji na bakteryjną toksynę, antrolizynę O. Na tym obrazie wapń jest pokazany w kolorze zielonym, a bromek aterium w czerwonych obszarach blisko mikrobiomu, co wykazuje śmierć komórek charakteryzującą się utratą wapnia i poborem homodimeru ate, podczas gdy obszary oddalone od końcówki nie wykazują żadnych uszkodzeń.

Mikrodostarczanie toksyny umożliwia również badanie zdarzeń w czasie rzeczywistym, takich jak przepływ jonów wapnia. Te ludzkie dcs naładowane 4:02 AM zostały poddane działaniu SLO przy stałej szybkości przepływu z jednoczesnym obrazowaniem na żywo, wykazując przejście z koloru zielonego na niebieski. Kolor pseudobarwiony wskazuje na wzrost poziomu wapnia cytozolowego.

SLO indukuje szybki wzrost stężenia wapnia w cytozolu, który rozprzestrzenia się w obszarze naczynia dzięki lokalnemu podaniu. Jednak tylko komórki znajdujące się blisko końcówki mikroinjektora stykają się z toksyną i reagują na nią. Demonstruje to zarówno reakcję pojedynczej komórki na toksynę, jak i przestrzennie ograniczony obszar podania toksyny w celu rozdzielenia zdarzeń w wymiarze zdi.

Mikrodostarczanie połączono z szybką konfokalną mikroskopią 3D. Ten zestaw obrazów przedstawia komórki dendrytyczne po wstrzyknięciu toksyny. Wcześniej inkubowano je z przeciwciałami anty-CD11c sprzężonymi z PC, widocznym na zielono, w celu oznakowania błony plazmatycznej.

Jak widać tutaj, mikropęcherzyki są uwalniane po dostarczeniu toksyny. W ramach procesu naprawy komórkowej cząsteczki toksyny koncentrują się w wypukłościach (blebach), które są odrzucane w celu eliminacji toksyny. Po opanowaniu techniki badanie mikroskopowe można przeprowadzić w 45 minut.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o przechowywaniu toksyny w niskiej temperaturze przed zmieszaniem jej z komórkami oraz o przetestowaniu aktywności hemolitycznej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat pomiaru kinetyki odpowiedzi komórek odpornościowych na toksyny bakteryjne w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopii żywych komórek.