Test eksplantacyjny do oceny zachowania komórkowego mezenchymy czaszki
20 stycznia 2013
Mezenchyma czaszki ulega gwałtownym ruchom morfogenetycznym, które prawdopodobnie stanowią siłę napędową dla uniesienia fałdów neuronalnych.1,2W niniejszym opracowaniu opisujemy prostą ex vivo test z eksplantem w celu charakterystyki zachowań komórkowych mezenchymy czaszki podczas neurulacji. Metoda ta znajduje liczne zastosowania, w tym możliwość wprowadzania manipulacji farmakologicznych oraz przeprowadzania analiz z wykorzystaniem obrazowania na żywo.
Celem niniejszej procedury jest monitorowanie zachowania hodowli meen chiming czaszkowych w określonych warunkach hodowlanych. Pierwszym krokiem jest pobranie rogów macicy od myszy w określonym czasie ciąży.
8,5 dnia po kopulacji. Po izolacji zarodki są usuwane z błony蜕szywej (decidua), a worek żółtkowy zostaje usunięty w celu genotypowania. Następnie fragmenty tkanek czaszkowych są mikrodysekcjowane i przenoszone na płytki hodowlane pokryte macierzą zewnątrzkomórkową.
Wycięte fragmenty tkanek X pozostawia się do przytwierdzenia i hoduje przez maksymalnie 48 godzin w obecności lub przy braku określonych czynników farmakologicznych. Ostatecznie wykonuje się zdjęcia eksplantów, aby wykazać różnice w migracji komórek. Metoda ta jest przydatna do odpowiedzi na kluczowe pytania, takie jak: jakie szlaki sygnalizacyjne i białka macierzy zewnątrzkomórkowej biorą udział w kontrolowaniu zachowania grzebienia neuralnego podczas unoszenia fałdów neuronalnych.
Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy mikrodysekcji są trudne do opanowania i wymagają cierpliwości oraz praktyki. Aby rozpocząć, jeśli planowane jest przeprowadzenie immunohistochemii, należy przygotować szkiełka nakrywkowe; w przeciwnym razie należy pominąć ten krok i bezpośrednio pokryć płytki do hodowli tkanek ECM. Sterylne okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm przygotowuje się poprzez zanurzenie ich w etanolu, a następnie pozostawia do wyschnięcia na powietrzu. Następnie do każdego dołka płytki 12-dołkowej należy włożyć sterylne szkiełko nakrywkowe.
Pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza, nanieś 1 mL macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), aby pokryć szkiełka nakrywki lub dno płytki do hodowli tkanek. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C przez trzy godziny. Po inkubacji odessać roztwór ECM i wypłukać trzykrotnie w PBS. Na tym etapie pokryte płytki można wykorzystać natychmiast lub zawinąć w folię i przechowywać w temperaturze 4 °C do dwóch tygodni.
Pomaga w wizualizacji przezroczystego embrionu. Przygotowuje się płytki osłonowe z odpornym czarnym tłem, zgodnie z protokołem producenta.
Przygotuj narzędzia do sekcji, wkładając szpilkę minutian do uchwytu na szpilki. Po przygotowaniu wszystkich elementów użyj ostrzałki do pęsety. Pobierz macicę od ciężarnej myszy w określonym czasie, 8,5 dnia po quot.
Umieść wyizolowaną macicę w naczyniu ze sterylnym PBS i wypłucz. Pod mikroskopem sekcyjnym oddziel poszczególne miejsca implantacji (decidua) za pomocą nożyczek i pęsety. Usuń tkankę łączną macicy ruchem rozdzierającym, uważając, aby nie wywrzeć nacisku i nie wypchnąć zarodka z decidua.
Za pomocą pęsety ostrożnie rozdarć tkankę macicy po stronie przeciwnej do łożyska. Aby odsłonić embrion zamknięty w pęcherzyku żółtkowym, należy pęsetą odseparować embrion wraz z pęcherzykiem żółtkowym od łożyska, a następnie usunąć tkankę macicy z naczynia. Następnie, delikatnie rozdzierając pęsetą, należy usunąć pęcherzyk żółtkowy z embrionu.
Za pomocą pipety przenieś worek żółtkowy do probówki typu Eppendorf w celu genotypowania; po izolacji określ stadium rozwoju zarodka, licząc somity. Idealnie zarodek powinien znajdować się między szóstym a dziesiątym somitem, co odpowiada stadium 6–10. Na tym etapie fałdy neuronalne dopiero zaczynają się unosić, a główna morfogeneza mezenchymy czaszki jeszcze nie nastąpiła.
Po określeniu stadium, przenieś embrion na czarną płytkę ochronną do komórek zawierającą DMEM bez czerwieni fenolowej. Najpierw, używając mikroskopu sekcyjnego z możliwie największym powiększeniem, skup się na głowie embrionu, trzymając w każdej ręce igłę sekcyjną, i przeprowadź sekcję głowy przedobwódkowo w stosunku do rmba. Następnie wykonaj cięcie wzdłuż linii środkowej, aby bi.
Przeciąć głowę na dwie równe połowy, trzymając w każdej dłoni igłę sekcyjną. Wypreparować zewnętrzne krawędzie wzdłuż marginesu głowy zarodka oraz linii środkowej. Usunąć zbędne tkanki, aby zapobiec pomyleniu pożądanych struktur z tkanką niepożądaną.
Wycinek będzie zawierał migrujący grzebień neuronalny czaszki, mezodermę osiową oraz ektodermę powierzchniową; należy usunąć luźno przytwierdzone komórki. Ostrożnie pipetuj ciecz w górę i w dół, używając końcówki do pipety 200 µL. Następnie ostrożnie pobierz wycinek za pomocą końcówki pipety.
W około 10 µL DMEM umieść w centrum powlekanej studni do hodowli tkankowej 20 µL ciepłego DMEM uzupełnionego o 15% FBS; naczynie hodowlane można teraz przenieść do inkubatora do hodowli tkanek. Po około jednej do dwóch godzinach eksplant przylega do powierzchni, po czym można dodać kolejne 250 µL pożywki. Po około 24 godzinach eksplant będzie trwale przytwierdzony do szkiełka podstawowego.
W tym momencie do pożywki można dodać środki farmakologiczne; po kolejnych 24 godzinach komórki wyjdą poza obszar przesiewu. Zazwyczaj wykonuje się zdjęcia, aby udokumentować odległość i liczbę komórek, które przemieściły się z obszaru przesiewu. W tym punkcie komórki zaczynają wykazywać oznaki obniżonej żywotności przy dłuższych czasach inkubacji.
Oto przykłady komórek migrujących z tkanek czaszkowych i chix. Po 48 godzinach w różnych podłożach zarówno kształt, jak i wielkość komórek migrujących z eksplantu są od nich zależne. Migracja na podłożu była wspierana przez fibronektynę, lamininę, max gel, ECM oraz kwas hialuronowy.
Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak immunofluorescencja i obrazowanie na żywo, aby dalej badać szlaki regulujące zachowanie mezenchymy czaszkowej podczas podnoszenia fałdów neuronalnych.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia prosty test eksplantów ex vivo służący do badania zachowań komórkowych mezenchymy czaszkowej podczas neurulacji. Test ten umożliwia manipulacje farmakologiczne oraz analizy obrazowania na żywo, dostarczając informacji o ruchach morfogenetycznych, które prowadzą do uniesienia fałdów nerwowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwoju
- Biologia komórki
Wprowadzenie
- Mezonchyma czaszki odgrywa krytyczną rolę w unoszeniu fałdów neuronalnych.
- Zrozumienie zachowań komórkowych podczas neurulacji jest kluczowe dla biologii rozwoju.
- Analizy ex vivo mogą dostarczyć cennych informacji na temat dynamiki komórkowej.
- Środki farmakologiczne mogą być wykorzystane do manipulowania tymi zachowaniami i ich obserwacji.
Cel badania
- Aby scharakteryzować zachowania komórkowe mezenchymy czaszkowej podczas neurulacji.
- Aby opracować test, który może być wykorzystany w badaniach farmakologicznych i obrazowych.
- Aby zbadać szlaki sygnałowe i białka macierzy pozakomórkowej uczestniczące w zachowaniu mezenchymy czaszkowej.
Zastosowane metody
- Izolacja zarodków z myszy w określonym czasie ciąży.
- Mikrodissekcja eksplantów mezenchymy czaszki.
- Hodowla eksplantów na płytkach powlekanych macierzą zewnątrzkomórkową.
- Obrazowanie na żywo w celu monitorowania migracji i zachowania komórek.
Główne wyniki
- Skuteczne przytwierdzenie i hodowla eksplantów mezenchymy czaszki.
- Obserwacja wzorców migracji komórek pod wpływem składu podłoża.
- Identyfikacja kluczowych szlaków sygnałowych uczestniczących w unoszeniu fałdów nerwowych.
- Wykazanie przydatności analizy do badań farmakologicznych.
Wnioski
- Analiza eksplantów ex vivo jest cennym narzędziem do badania dynamiki mezenchymy czaszkowej.
- Manipulacje farmakologiczne mogą dostarczyć wiedzy na temat zachowań komórkowych podczas neurulacji.
- Metoda ta może wspomóc dalsze badania nad procesami rozwojowymi i powiązanymi z nimi zaburzeniami.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten test na eksplantach ex vivo umożliwia mechanistyczne badanie zachowań mezenchymy czaszkowej podczas neurulacji, wspierając walidację celów w szlakach rozwojowych. Poprzez ilościowe określenie migracji komórek na zdefiniowanych podłożach ECM, pozwala on na zwiększenie pewności prognostycznej w celu redukcji ryzyka związanych z hipotezami dotyczącymi czynników morfogenetycznych odpowiedzialnych za tworzenie cewy nerwowej. Kompatybilność testu z perturbacjami farmakologicznymi oraz obrazowaniem na żywo pozycjonuje go jako pomost translacyjny pomiędzy biologią odkrywczą a modelowaniem przedklinicznym procesów rozwoju neurologicznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez izolację mezynchymu czaszkowego w celu wyjaśnienia wkładu konkretnych szlaków w uniesienie fałdów nerwowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez funkcjonalną walidację zachowań komórek mezenchymalnych w systemie istotnym dla danej jednostki chorobowej.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez powiązanie oddziaływań substratu ECM z fenotypami migracyjnymi, co pozwala na określenie stopnia pewności co do wybranego celu terapeutycznego.
Przesiew i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez standaryzację przywierania eksplantów oraz odczytów migrację.
- Wartość operacyjna: Zwiększa odtwarzalność testów dzięki zdefiniowanym warunkom hodowli i ilościowym wynikom na fibonektynie, lamininie, Matrigelu, ECM oraz kwasie hialuronowym.
- Wartość strategiczna: Podkreśla gotowość do przesiewu oraz możliwość ponownego wykorzystania platformy do oceny wpływu związków na dynamikę migracji mezenchymalnej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Omówienie związku z chorobami poprzez zestawienie z wadami neurulacji oraz potencjału translacyjnego biomarkerów w migrujących populacjach komórek.
- Wartość operacyjna: Opis ciągłości od etapu odkryć po walidację przedkliniczną dzięki umożliwieniu obrazowania na żywo i farmakologicznego badania szlaków sygnalizacyjnych.
- Wartość prognostyczna: Wsparcie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez pomiar zachowań komórkowych, które pozwalają przewidzieć wyniki morfogenetyczne w procesie zamykania rurki nerwowej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza ta wpisuje się w kontinuum procesu badawczego od etapu wczesnego odkrywania (Early Discovery) do identyfikacji wiodących związków (Lead Identification), wspierając weryfikację hipotez oraz wyjaśnianie szlaków sygnałowych w procesach biologii rozwoju.
- Biologia odkrywcza: Wyjaśnia, w jaki sposób metoda ta wspiera testowanie hipotez poprzez izolację mezenchymy czaszkowej w celu zbadania szlaków sygnalizacyjnych napędzających reorganizację mezenchymy.
- Przesiewanie: Opisuje gotowość do analizy poprzez standaryzowaną hodowlę eksplantatów na płytkach powlekanych ECM oraz ilościowy pomiar liczby i dystansu migracji komórek.
- Analityka: Wskazuje na pomiary, takie jak liczba komórek migrujących i zmiany morfologiczne, które umożliwiają porównanie warunków w zależności od zmiennych farmakologicznych lub substratowych.
- Badania translacyjne: Łączy metodę z ciągłością przedkliniczną, umożliwiając obrazowanie na żywo oraz badania farmakologiczne, które dostarczają danych do modeli wad neurulacji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia metodę jako powtarzalne rozwiązanie do badania oddziaływań między mezenchymą a ECM w odniesieniu do wielu celów neurorozwojowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna, walidacja celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w morfogenezie mezenchymalnej.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność testów eksplantacyjnych na zdefiniowanych podłożach ECM.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa oraz zredukowane biologiczne ryzyko na późnych etapach programów neurorozwojowych.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje o rozwoju oparte na ilościowych fenotypach migracji.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana wiedza specjalistyczna w zakresie technik dyssekcji i mikrodysekcji embrionów.
- Potrzeby w zakresie instrumentarium i infrastruktury analitycznej do obrazowania na żywo oraz obsługi związków farmakologicznych.
- Wymagania dotyczące standaryzacji międzyzespołowej w przygotowaniu eksplantatów i spójności powłok ECM.
- Rozważania dotyczące adaptacji w różnych systemach modelowych ze względu na gatunkową specyfikę składu mezenchymy i etapów rozwoju.
- Ograniczenia praktyczne, w tym żywotność tkanki powyżej 48 hours oraz zależność od precyzyjnego określenia etapu rozwoju somitów embrionalnych.
