Wizualizacja bakterii w nicieniach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obserwacja fluorescencyjnie znakowanej symbiozy bakteryjnej wewnątrz gospodarza z rodzaju nicieni. Osiąga się to poprzez uprzednie znakowanie bakterii białkiem fluorescencyjnym za pomocą konjugacji. Drugim krokiem jest izolacja nicieni AIC poprzez zbieranie jaj.

Następnie nicienie AIC są hodowane wraz z ich fluorescencyjnie znakowanym symbiontem bakteryjnym, aby umożliwić naturalną asocjację, a w konsekwencji lokalizację symbionta bakteryjnego wewnątrz organizmu gospodarza. Częstość tej asocjacji w populacji nicieni można określić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu symbiozy, takie jak: gdzie bakterie lokalizują się wewnątrz gospodarza oraz jaki jest rozkład kolonizacji bakteryjnej w populacji gospodarzy?

Po nocnej inkubacji szczepów bakteryjnych, przenieś subkultury szczepu donora, biorcy oraz pomocniczego do bogatego pożywki wzrostowej pozbawionej antybiotyków w stosunku 1:100 kultury do pożywki, a następnie inkubuj kultury w temperaturze odpowiedniej dla każdego szczepu, aż osiągną fazę wzrostu logarytmicznego. Następnie połącz szczepy w jednej probówce do mikrocentryfugi i wiruj zmieszane kultury przez dwie minuty przy 17 900 Gs, odlej nadosad i resuspenderuj osad w 30 µL świeżej pożywki. Potem nanieś zawiesinę w formie plamki na płytkę z bogatą pożywką bez antybiotyków i odczekaj, aż plamka wyschnie.

Inkubuj płytkę w pozycji odwróconej przez noc w temperaturze optymalnej dla bakterii biorącej oraz dopuszczalnej dla dawcy i pomocnika, jeśli dotyczy. Następnie zeskrob zawartość plamki i wykonaj posiew smugowy na selektywnej płytce z antybiotykiem w celu uzyskania czystej kultury bakterii, izolując pojedyncze kolonie. Na koniec upewnij się, że uzyskane kolonie są symbiontem biorącym, a nie szczepem dawcy.

Poprzez przesiewową weryfikację obecności fenotypów specyficznych dla biorcy. Na przykład bakterie cino abdi można odróżnić od e coli, wykonując test katalazy, lub sprawdzić obecność plazmidu, potwierdzając fluorescencję przy długości fali odpowiadającej fluorescencyjnemu białku plazmidowemu. Po nocnej hodowli naturalnego symbionta bakteryjnego, nanieś 600 µL kultury bakteryjnej na 8–10 płytek agarowych o średnicy 10 mm, a następnie inkubuj płytki w ciemności, bez dostępu wilgoci, w temperaturze 25 °C.

Po dwóch dniach należy dodać 5 000 zakaźnychstadiów młodzieńczych nicieni w 500 µL pożywki na lawns bakterii. Po inkubacji płytek w temperaturze 25 °C przez kolejne trzy dni, należy nanieść 20 µL wody na szkiełko przedmiotowe. Następnie za pomocą sterylnego patyczka należy zebrać niewielką ilość nicieni z lawnu bakterii.

Zanurz patyczek w wodzie, aby umożliwić nicieniom wypłynięcie. Obejrzy preparat pod małym powiększeniem. Jeśli widoczne są jaja i samice, kontynuuj procedurę w momencie, gdy samice zawierają jaja; nalej kilka mililitrów wody na powierzchnię płytek, delikatnie nimi zakręć, a następnie przelej wodę do probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów.

Nematody powinny oderwać się od płytek i nie być już widoczne na ich powierzchni. Należy poczekać, aż nematody opadną na dno probówki, a następnie odpipetować nadmiar wody z górnej części probówki i ponownie napełnić ją czystą wodą. Po ponownym opadnięciu dorosłych nematod na dno i ponownym odpipetowaniu nadmiaru wody, należy napełnić probówki stożkowe roztworem do pozyskiwania jaj.

Następnie wymieszaj zawartość probówek poprzez delikatne odwracanie przez dokładnie 10 minut w temperaturze pokojowej. Po wymieszaniu natychmiast odwiruj probówki stożkowe przez dokładnie 10 minut przy 1 250 Gs w temperaturze pokojowej z włączonym hamulcem. Następnie szybko odlej supernatant, resuspenduj osad w roztworze jajek poprzez pipetowanie i napełnij probówkę stożkową świeżym roztworem jajek.

Dobrze wymieszaj zawiesinę jaj, odwracając probówkę od trzech do pięciu razy, a następnie natychmiast odwiruj jaja i odlej nadsącz, tak jak właśnie pokazano. Resuspenduj osad w bulionie misogyny lub LB, pipetując, a następnie przenieś zawiesinę jaj do stożkowatej probówki o pojemności 15 ml. Teraz napełnij probówkę 15 ml bulionem LB, przemyj jaja trzy razy w bulionie, stosując tę samą technikę szybkich kroków, która została właśnie zaprezentowana, a następnie rozcieńcz resuspendowane jaja nicieni P do stężenia co najmniej 10 jaj na µL.

Przenieś jaja do sześciocentymetrowej szalki Petri zawierającej 5 mL pożywki LB i antybiotyki przeciwko bakteriom kolonizującym. Płytkę można przechowywać zawiniętą w folię przez maksymalnie cztery dni po nocnym namnożeniu i selekcji bakterii fluorescencyjnych. Za pomocą sterylnego rozpylacza nanieś 600 µL kultury bakteryjnej na 10 mm lipidowe aeraty i inkubuj kulturę w temperaturze 25 °C.

Po dwóch dniach nanieś od 500 do 5 000 jaj nicieni na każdą płytkę lipidową. Jeśli płytka była przechowywana, przed zaszczepieniem jaj na wcześniej przygotowane lawns bakterii należy co najmniej raz przemyć jaja w 15 mililitrach LB, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Następnie inkubuj kokultury nicieni i bakterii w ciemności, bez dostępu wilgoci, w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aż do pojawienia się infekcyjnych stadiów młodzieńczych w postaci puszystego białego pierścienia na krawędzi płytki.

Po zaobserwowaniu zakaźnych stadiów młodzieńczych należy zdjąć pokrywkę z płytki z agarem lipidowym i umieścić dno płytki na dnie pustego zestawu Petriego o wymiarach 100 mm na 20 mm. Następnie należy napełnić naczynie Petriego wodą do poziomu około połowy wysokości mniejszej płytki i inkubować pułapkę wodną do momentu, aż potomne zakaźne stadia młodzieńczyche wydostaną się do wody.

Po zebraniu nicieni z wody lub w pożądanym stadium rozwojowym z odpowiedniego trawnika bakteryjnego, rozpuść kilka ziaren ole w 30 µL wody, a następnie dodaj od 1 do 2 µL tego środka paraliżującego na każde 50 µL próbki nicieni. Następnie przenieś około 20 do 30 µL sparaliżowanej próbki nicieni na szkiełko mikroskopowe i przykryj próbkę szkiełkiem nakrywką. Obejrzyj nicienie pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że znajdują się one w polu widzenia.

Aby zidentyfikować lokalizację bakterii, należy sfotografować nicienie przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej oraz mikroskopii świetlnej, a następnie nałożyć obrazy na siebie. Może być konieczne przetestowanie kilku powiększeń i różnych ujęć nicienia w celu zlokalizowania bakterii.

Zliczono populacje nicieni z dwóch środowisk i oceniono stopień kolonizacji przez symbiotyczne bakterie. W celu uzyskania wiarygodnych statystyk najlepiej zliczyć co najmniej 100 nicieni na próbkę, tak aby co najmniej 30 osobników znalazło się w każdej z kategorii przedstawionych w tabeli. Nicienie te są skolonizowane na poziomie około 14,6% przy hodowli na agarze lipidowym oraz 68,6% przy hodowli na agarze wątrobowo-nerkowym.

Wykazano, że inne gatunki nicieni i bakterii wykazują różny stopień kolonizacji. Ten schemat ilustruje ogólny wygląd samic Steiner NEMA. Wstawka przedstawia obraz kontrastu interferencyjnego różnicowego samicy S fot przy 20-krotnym powiększeniu.

Czarna strzałka na powiększeniu wskazuje srom, natomiast białe strzałki wskazują widoczne jaja. Ten obraz przedstawia rozwinięte, ale niewyklute jajo nicienia z rodzaju Volta przy powiększeniu 40x, a jaja wyizolowane z nicieni Volta zostały zobrazowane przy powiększeniu 10x. Na tym pierwszym obrazie przedstawiono reprezentatywne zdjęcia mikroskopowe nicieni Steiner Nima związanych z bakteriami Xeno aptus.

Nematody Alvina zostały powiązane z ich bakteryjnym symbiontem wykazującym ekspresję GFP w celu stworzenia tego obrazu kompozytowego. Obraz kontrastowy fazowy został nałożony na obraz fluorescencyjny. Strzałka wskazuje bakterie obecne wewnątrz infekcyjnego stadium młodzieńczego nematody.

Na tym obrazie przedstawiono młodego nicienia S carpa capsi z GFP wykazującym X nla. Obraz został przygotowany w podobny sposób jak poprzedni i przedstawia młodego nicienia z bakteriami znakowanymi zielonym białkiem fluorescencyjnym, widocznymi jako zielone pręciki zlokalizowane w całym świetle jelita nicienia. Poza opisaną procedurą można zastosować inne metody, takie jak manipulacje genetyczne symbionta bakteryjnego przed związaniem z organizmem gospodarza, w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące molekularnych mechanizmów niezbędnych do nawiązania związku między gospodarzem a mikrobem.