Porównawcza analiza struktury RNA transkryptów powstających i dojrzałych u Saccharomyces cerevisiae
27 lutego 2026
Struktura wtórna RNA została głównie zaobserwowana w dojrzałym RNA metodami sondowania struktury. Sekwencjonowanie śledzenia struktury kotranskrypcyjnej (CoSTseq) jednoczy jądrowy run-on, który był wykorzystywany do badania pozycji polimerazy na powstającym RNA, z wykorzystaniem sondowania struktury. CoSTseq umożliwia tym samym obserwację wtórnej struktury RNA w RNA podczas aktywnej transkrypcji.
Badaliśmy przetwarzanie RNA kotranskrypcyjnego, w tym jak rodzące się RNA fałduje podczas wyłaniania się z polimerazy RNA, która je syntetyzuje. Przed tą metodą nie byliśmy w stanie monitorować, jak RNA fałduje się podczas syntezy, co hamowało nas w badaniach. Ta nowa metoda przezwycięża te luki.
CoSTseq został opracowany w celu badania rozwijającego się fałdowania RNA w drożdżach. Jest szczególnie skuteczny w analizie bardzo obfitych RNA. Na początek inokuluj szczep Saccharomyces cerevisiae BY4741 w 50 mililitrach podłoża YPAD i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza z potrząsaniami z prędkością 200 obrotów na minutę, aż hodowla osiągnie fazę środkową logarium.
Zbierz około trzech mililitrów kultury drożdżowej odpowiadającej 1,8 jednostki gęstości optycznej i wiruj w 2 500 x g przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą wstępnie schłodzonej wirówki. Zrzuć supernatant do pojemnika na odpady. Ponownie zawiesić granulek w 10 mililitrach zimnego PBS i ponownie wirować w dawce 2 500 x g przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Usuń supernatant i trzymaj granulat drożdżowy na lodzie. Ostrożnie ponownie zawiesz granulat drożdżowy w 10 mililitrach zimnego 0,5% sarkosylu, nie tworząc przy tym bąbelków. Inkubuj ponownie zawieszone drożdże na lodzie przez 20 minut, aby umożliwić przenikliwość, następnie wypuszczaj komórki w granulach 400 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ponownie zawiesijuj przepuszczalne komórki drożdży w 100 mikrolitrach wody wolnej od nukleazy za pomocą pipety P-1000.
Przygotuj roboczy roztwór buforu transkrypcyjnego 2,5X z świeżo dodanym ditiotreitolem o 5 milimolarach i podgrzej bufor sondujący strukturę 2,5X do 30 stopni Celsjusza. W czystej tubce o dwóch mililitrach dodaj wszystkie wymagane składniki reakcji i dokładnie wymieszaj. Następnie dodaj 100 mikrolitrów przygotowanych komórek drożdży do probówki reakcyjnej i inkubuj je w termomikserze ustawionym na 30 stopni Celsjusza, potrząsając z prędkością 500 obrotów na minutę przez dwie minuty.
Następnie szybko dodaj 200 mikrolitrów wcześniej podgrzanego buforu 2,5X do badania struktury oraz 25 mikrolitrów odczynnika dimetylosiarczanowego jednocześnie. Delikatnie zawiruj rurkę w dwóch impulsach i umieść ją z powrotem w inkubatorze ustawionym na 30 stopni Celsjusza i 500 obrotów na minutę. Kontynuuj inkubację na termomikserze przez cztery minuty, z odstępem 30 sekund między próbkami.
Przygotuj wcześniej bufory stop-and-wash i umieść je w lodzie do czasu użycia. Zatrzymaj metylację siarczanu dimetylowego, dodając jeden mililitr buforu stopowego do probówki reakcyjnej. Następnie wiruj próbki oznaczone dimetylosiarczanem w stężeniu 3 500 x g przez pięć minut w wirówce wstępnie schładzającej.
Po obróceniu wyrzuć supernatant do odpowiedniego pojemnika na odpady. Dodaj do pelletu jeden mililitr schłodzonego buforu do mycia i ponownie zawiesij. Powtarzaj wirowanie w dawce 3 500 x g przez pięć minut.
Natychmiast przejdź do ekstrakcji RNA i nie zamrażaj granulek drożdżowych. Ponownie zawiesić granulat drożdżowy oznaczony siarczanem dimetylu w 600 mikrolitrach buforu lizycznego RNA, a następnie przenieść zawiesinę do probówki zawierającej 40 mikrolitrów 20% siarczanu sodu dodecylowego. Inkubuj próbkę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 30 sekund, z potrząsaniem z prędkością 950 obrotów na minutę.
Następnie wykonaj ekstrakcji RNA fenochloroformem zgodnie ze standardową procedurą. Wykonaj wir magnetycznych kulek streptawidyny i przenieś 44 mikrolitry tych kulek do nowej probówki na każdą próbkę o łącznej pojemności 80 mikrogramów RNA. Umieść magnetyczne koraliki na magnetycznym stojaku, aż kulki się ułożą.
Po usunięciu bufora magazynowego ponownie zawiesz kulki w jednym mililitrze bufora pre-wash A. Następnie inkubuj zawiesinę przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, następnie namagnesuj i usuń supernatant. Po umyciu ponownie zawiesij kulki w 88 mikrolitrach buforu wiążącego 2X. Przelej 80 mikrolitrów zawiesiny do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra zawierającej 80 mikrogramów biotinylowanej próbki RNA w 80 mikrolitrach.
Obróć mieszankę z kulek na rotatorze przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umieszczam rurkę na magnetycznym stojaku, aby zebrać przepływ zawierający dojrzałe RNA i zachować je na wytrącanie, aby wykonać selekcję poli-A dojrzałych RNA przy użyciu DMS-MaPseq. Następnie dwukrotnie płucz kompleks RNA powstający w kulkach 500 mikrolitrami buforu o wysokiej zawartości soli.
Następnie raz przepłukaj 500 mikrolitrami buforu wiążącego 1X, a na koniec 500 mikrolitrów buforu o niskiej zawartości soli. Następnie dodaj 300 mikrolitrów odczynnika RNA do kulki=nowo powstającego kompleksu RNA, dokładnie zawiesij i inkubuj na termomieszaku przez pięć minut w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 60 mikrolitrów chloroformu, zainkubuj i inkubuj przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.
Wiruj próbkę w 14 000 x g przez pięć minut w wirówce wstępnej schładzania. Na koniec przelej górną fazę wodną około 180 mikrolitrów do nowej probówki zbiorczej. Usuń pozostałą fazę organiczną, pozostawiając koraliki i resztki roztworu wodnego.
Po oczyszczeniu powstającego RNA wykonaj odwrotną transkrypcję przełączającą szablon, liguj adapter 5' i wybierz biblioteki do sekwencjonowania. Wizualizacja testowych produktów PCR na żelu o wartości 1% agarozy wykazała minimalne powstawanie dimerów primerów oraz charakterystyczne rozmazanie około 300 par zasad dla sekwencjonowania struktury transkrypcyjnej lub bibliotek CoSTseq i DMS-MaPseq. Elektroferogram dla próbki CoSTseq pierwszej potwierdził rozkład wielkości biblioteki z pikiem około 285 par zasad.
Odczyt odczytu mRNA ASC1 ujawnił, że biblioteka CoSTseq obejmuje pokrycie całego intronu, co potwierdza, że RNA jest dopiero w zarodku. Natomiast biblioteka DMS-MaPseq nie miała pokrycia intronowego, co wskazuje, że RNA jest dojrzałe. Matryca składania transkrypcyjnego cot 18S przed rRNA wykazała, że reaktywność DMS wykazywała nagłe zmiany, gdy polimeraza RNA przesuwała się z pozycji 790 do 811 wzdłuż locus rDNA.
Analiza reaktywności DMS mRNA ADH1 wykazała podobne profile między formami młodymi a dojrzałymi, wskazując na obszary stabilności strukturalnej. Dla porównania, mRNA SSA2 wykazywało obszary o różnej reaktywności DMS między formami młodymi a dojrzałymi, co sugeruje zmiany strukturalne podczas dojrzewania. Dzięki CoSTseq naukowcy mogą określić in vivo powstające struktury wtórne RNA oraz pozycję polimerazy RNA wzdłuż transkryptów RNA.
CoSTseq ma kroki o ograniczonym czasie, używa toksycznych chemikaliów. Lepiej przetwarzać nie więcej niż dwie próbki jednocześnie. Z całkowitego RNA wygenerowanego przez CoSTseq, niebiotynowo wykorzystane RNA mogą być wykorzystywane do jednoczesnego badania dojrzałych struktur przy użyciu tradycyjnego DMS-MaPseq.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia sekwencjonowanie z monitorowaniem struktury w trakcie transkrypcji (CoSTseq), metodę badania struktury drugorzędowej nowo powstającego RNA w momencie jego syntezy przez polimerazę RNA w Saccharomyces cerevisiae. CoSTseq umożliwia jednoczesne mapowanie pozycji polimerazy RNA oraz stanu parowania zasad RNA, co pozwala pokonać wcześniejsze ograniczenia w badaniu przejściowych, niskokopiowych transkryptyów nascentnych. Protokół ten umożliwia również równoległą analizę struktur dojrzałego RNA z wykorzystaniem metody DMS-MaPseq.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Biologia RNA
- Genomika strukturalna
- Genetyka molekularna
Wstęp
- Drugorzędowe struktury RNA tworzące się podczas transkrypcji wpływają na ekspresję genów, przetwarzanie RNA, translację oraz stabilność.
- Tradycyjne metody analizują głównie dojrzałe RNA, przez co proces fałdowania się RNA w fazie nascentnej pozostaje słabo rozpoznany.
- Cząsteczki nascentnego RNA są rzadkie i przejściowe, co sprawia, że ich izolacja i charakterystyka strukturalna są trudne.
- Zrozumienie fałdowania kotranskrypcyjnego jest kluczowe dla wyjaśnienia funkcji i regulacji RNA.
Cel badania
- Opracowanie i zademonstrowanie protokołu pozwalającego na uchwycenie struktury nowo powstającego RNA in vivo.
- Jednoczesne określenie pozycji polimerazy RNA oraz stanu parowania zasad RNA podczas transkrypcji.
- Porównanie struktur RNA nowo powstającego i dojrzałego w ramach tego samego schematu doświadczalnego.
Zastosowane metody
- Wzrost i przygotowanie kultur S. cerevisiae.
- Transkrypcyjny run-on z włączeniem biotynowych NTP w celu zatrzymania polimerazy RNA w miejscach aktywnych.
- Obróbka DMS (siarczanem dimetylu) w celu zmetylowania nieparzystych nukleotydów A, C i U w RNA.
- Wzbogacanie nowo powstałego RNA na podstawie biotyny przy użyciu magnetycznych kulek z streptawidyną.
- Ekstrakcja RNA, odwrotna transkrypcja z przełączaniem matrycy i przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania.
- Równoległy schemat DMS-MaPseq do analizy struktury dojrzałego RNA.
Główne wyniki
- Biblioteki CoSTseq wykazały pokrycie w obrębie intronów, co potwierdza wychwyt RNA prekursorowego, podczas gdy biblioteki DMS-MaPseq nie wykazały pokrycia intronów, co wskazuje na RNA dojrzałe.
- Profile reaktywności DMS ujawniły gwałtowne zmiany strukturalne w pre-rRNA 18S w miarę postępu polimerazy RNA wzdłuż genu.
- mRNA ADH1 wykazywał podobną reaktywność DMS w formach prekursorowej i dojrzałej, co sugeruje stabilność strukturalną.
- mRNA SSA2 wykazał różnice w reaktywności DMS między formami prekursorową a dojrzałą, co wskazuje na przebudowę strukturalną podczas dojrzewania.
Wnioski
- Metoda CoSTseq umożliwia mapowanie struktur drugorzędowych nowo powstającego RNA oraz pozycji polimerazy RNA in vivo.
- Metoda ta dostarcza informacji na temat kotranskrypcyjnego fałdowania RNA i przejść strukturalnych podczas dojrzewania RNA.
- Metodę CoSTseq można przeprowadzić równolegle z DMS-MaPseq w celu kompleksowej analizy dynamiki struktur RNA.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla sektora przemysłowego
Sekwencjonowanie z jednoczesnym śledzeniem struktury w trakcie transkrypcji (CoSTseq) umożliwia bezpośrednią analizę fałdowania powstającego RNA oraz pozycji polimerazy in vivo, wypełniając krytyczną lukę w zrozumieniu dynamiki struktury RNA podczas transkrypcji. Możliwość ta zwiększa pewność przewidywań w badaniach nad regulacją genów i wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka na etapie walidacji celu. Integracja analizy struktury RNA powstającego i dojrzałego dostarcza informacji kluczowych dla decyzji na wczesnym etapie odkrywania leków oraz segregacji portfela w rozwoju terapeutyków celujących w RNA.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie stanów zwinięcia RNA w miarę powstawania transkryptów z polimerazy RNA.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez mapowanie przejść strukturalnych istotnych dla regulacji genów.
- Zwiększa pewność prognostyczną w hipotezach terapeutycznych celujących w RNA.
- Ułatwia selekcję projektów poprzez odróżnianie stabilnych od dynamicznych regionów RNA.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane zestawy danych o strukturze RNA dla dalszych etapów przepływu pracy w badaniach przesiewowych.
- Umożliwia standaryzację testów poprzez dostarczenie ilościowych profili reaktywności DMS.
- Wspiera powtarzalność dzięki równoległej analizie transkryptów powstających i dojrzałych.
- Ułatwia wiarygodną ocenę wpływu związków na strukturę RNA.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie analizy struktury RNA z systemami ekspresji genów istotnymi dla przebiegu chorób.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkryć po przedkliniczną walidację mechanizmów celowanych w RNA.
- Umożliwia optymalizację postępów z uwzględnieniem ryzyka poprzez ujawnienie przebudowy strukturalnej podczas dojrzewania RNA.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w strategiach terapeutycznych opartych na RNA.
Integracja potoku i przepływu pracy
CoSTseq integruje się z procesem badawczym, od wczesnego testowania hipotez, przez identyfikację wiodących cząsteczek, aż po badania przedkliniczne, umożliwiając kompleksową analizę struktury RNA na wielu etapach procesu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez mapowanie fałdowania nowo powstającego RNA in vivo.
- Screening: Zapewnia ilościowe, powtarzalne wyniki reaktywności DMS w celu przygotowania do analizy.
- Analityka: Dostarcza dane z sekwencjonowania par końcowych (paired-end) do porównywania stanów strukturalnych w trakcie dojrzewania transkrypcji.
- Badania translacyjne: Łączy dynamikę struktury RNA z ekspresją genów istotną dla chorób i dopasowaniem biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do analizy struktury RNA dla różnych celów i warunków.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad odkrywaniem celów RNA.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje sondowanie struktury RNA dzięki skalowalnym i zrównoleglonym przepływom pracy.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji go/no-go oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez wyjaśnienie przejść strukturalnych RNA.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój programów ukierunkowanych na RNA.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza z zakresu biologii RNA, sekwencjonowania oraz technik sondowania chemicznego.
- Niezbędny jest dostęp do platform sekwencjonowania paired-end oraz infrastruktury analitycznej do analizy reaktywności DMS.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie obchodzenia się z próbkami i interpretacji danych.
- Można potrzebować adaptacji metody dla różnych szczepów drożdży lub poziomów obfitości RNA.
- Przepustowość jest ograniczona przez kroki wrażliwe na czas oraz obchodzenie się z toksycznymi odczynnikami chemicznymi.
