Demonstracja techniczna porównawczej hybrydyzacji genomowej całego genomu z wykorzystaniem macierzy (array CGH)
5 sierpnia 2008
531 wyświetleń
Niniejsze wideo jest demonstracją techniczną protokołu hybrydyzacji dla zestawu CGH z płytkami o gęstym pokryciu całego genomu (whole genome tiling path array CGH), który pozwala na przeskanowanie całego ludzkiego genomu przy użyciu zaledwie 25-100 ng DNA, które można wyizolować z różnych źródeł, w tym z archiwalnego materiału utrwalonego w formalinie.
*Preparaty mogą pozostać w
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym filmie zaprezentowano protokół hybrydyzacji dla macierzy CGH typu whole genome tiling path, umożliwiający skanowanie całego ludzkiego genomu przy minimalnej ilości wejściowego DNA. Metoda ta pozwala na analizę różnych typów próbek, w tym materiałów archiwalnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genomika
- Analiza DNA
- Techniki hybrydyzacji
Wstęp
- Macierz składa się z 26 946 indywidualnie zsekwencjonowanych klonów zwrotnych.
- Każne szkiełko zawiera łącznie 54 000 elementów.
- Uzyskane dane są porównywalne z macierzami oligo o wysokiej gęstości.
- Analiza danych nie wymaga interpretacji bioinformatycznej.
Cel badania
- W celu zaprezentowania protokołu hybrydyzacji do skanowania genomu.
- W celu wykorzystania minimalnych próbek DNA do kompleksowej analizy genomowej.
- W celu ułatwienia zastosowania różnorodnych typów próbek w badaniach genomicznych.
Zastosowane metody
- Protokół hybrydyzacji dla analizy CGH z wykorzystaniem macierzy pokrywającej cały genom (tiling path array).*
- Wykorzystanie 25-100 ng DNA z różnych źródeł.
- Zastosowanie klonów odwrotnych naniesionych w duplikatach na preparaty.
- Analiza próbek bez amplifikacji.
Główne wyniki
- Skuteczne skanowanie genomu ludzkiego przy niskiej ilości wejściowej DNA.
- Możliwość analizy DNA z krwi, mrożonych tkanek oraz materiału FFPE.
- Jakość danych porównywalna z macierzami o wyższej gęstości.
- Uproszczona analiza bez konieczności stosowania zaawansowanych narzędzi bioinformatycznych.
Wnioski
- Protokół hybrydyzacji jest skuteczny w analizach obejmujących cały genom.
- Minimalne wymagania dotyczące ilości DNA rozszerzają zakres typów próbek.
- Metoda ta zwiększa dostępność badań genomicznych.
Często zadawane pytania
Jaka jest główna zaleta tego protokołu hybrydyzacji?
Główną zaletą jest możliwość użycia tak niewielkiej ilości DNA jak 100 ng, co pozwala na analizę różnych typów próbek bez konieczności amplifikacji.
Jakie rodzaje próbek można analizować?
Próbki obejmują DNA z krwi, zamrożonych tkanek, sortowanych komórek oraz archiwalnego materiału FFPE.
Jak ta metoda wypada w porównaniu do macierzy oligonukleotydowych o wysokiej gęstości?
Uzyskane dane są porównywalne, lecz metoda ta nie wymaga złożonej interpretacji bioinformatycznej.
Jaki jest rozmiar macierzy użytej w tym protokole?
Matryca składa się z 26 946 indywidualnie zsekwencjonowanych klonów odwrotnych naniesionych na pojedynczy preparat.
Ile elementów jest drukowanych na każdym szkiełku?
Łącznie 54 000 elementów jest drukowanych w duplikacie na każdym slajdzie.
Czy w tym protokole konieczna jest amplifikacja DNA?
Nie, amplifikacja nie jest konieczna, co umożliwia bezpośrednią analizę niskich ilości DNA.
Znaczenie dla przemysłu
Array CGH umożliwia wykrywanie zmian liczby kopii DNA w całym genomie przy minimalnej ilości materiału wejściowego, co wspiera walidację celów w badaniach nad onkologią i chorobami genetycznymi. Metoda ta zmniejsza zależność od specjalistycznej wiedzy z zakresu bioinformatyki, przy zachowaniu jakości danych porównywalnej z macierzami o wysokiej gęstości. Ułatwia to szersze zastosowanie w procesach badawczych, w których częstymi wyzwaniami są niedobór oraz heterogeniczność próbek.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie zmian genomowych w obrębie całego genomu w celu weryfikacji hipotez dotyczących celów molekularnych.
- Wartość operacyjna: Metoda działa przy użyciu zaledwie 25-100 ng nieamplifikowanego DNA, co pozwala na wykorzystanie cennych lub archiwalnych próbek.
- Wartość prognostyczna: Wykrywa zmiany wielkości zaledwie 50 kb, zapewniając rozdzielczość niezbędną do wczesnego etapu minimalizacji ryzyka mechanistycznego.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe dane o stosunku log2 dla każdego celu BAC w celu obiektywnego porównania genomów próbki i referencyjnych.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje oprogramowanie SeeGH do przetwarzania 53 892 punktów danych na eksperyment, standaryzując wyniki dla dalszych analiz.
- Powtarzalność: Podwójne naniesienie klonów BAC zwiększa niezawodność sygnału i zmniejsza zmienność techniczną.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Kompatybilność z DNA z materiału FFPE umożliwia wykorzystanie klinicznie istotnych, archiwalnych próbek pacjentów.
- Tolerancja heterogeniczności tkankowej: Duży rozmiar insertu BAC zmniejsza potrzebę mikrodysekcji, co wspomaga analizę złożonych próbek tkankowych.
- Modelowanie przedkliniczne: Wykrywa przyrosty, ubytki, amplifikacje i delecje homozygotyczne DNA istotne dla modelowania chorób.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesów odkrywczych, od identyfikacji celu po walidację przedkliniczną, szczególnie w sytuacjach, gdy zmiany genomiczne pozwalają na zrozumienie mechanizmów działania.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badania przesiewowe oparte na hipotezach w celu wykrycia zmian liczby kopii powiązanych z onkogenami lub supresorami nowotworów.
- Analityka: Generuje log2 ratio dopasowane do pozycji chromosomowych, co umożliwia wizualną i ilościową ocenę niestabilności genomowej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Protokół jest zestandaryzowany i może być stosowany w wielu laboratoriach, przy minimalnej potrzebie specjalistycznego wsparcia bioinformatycznego.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Detekcja zmian w DNA o wysokiej rozdzielczości pomaga w potwierdzeniu trafności celu oraz wyjaśnieniu szlaków sygnałowych.
- Wartość operacyjna: Niska ilość wymaganego DNA oraz tolerancja na nieczyste próbki zwiększają dostępność metody i zmniejszają obciążenie związane z wstępnym przetwarzaniem.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie decyzji typu go/no-go na podstawie profili genomicznych bez konieczności posiadania infrastruktury do sekwencjonowania.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zwalidowane zmiany genomiczne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie znakowania kwasów nukleinowych, hybrydyzacji oraz detekcji fluorescencyjnej.
- Metoda zależy od dostępności kaset do hybrydyzacji, inkubatorów z kontrolą temperatury oraz skanerów do mikromacierzy.
- Ilościowe oznaczenie za pomocą NanoDrop jest niezbędne do oceny jakości DNA oraz wydajności wbudowywania barwnika.
- Konieczna jest optymalizacja protokołu dla różnych typów próbek, w tym materiałów FFPE i materiałów o niskiej zawartości wejściowej.
- Podczas skanowania należy monitorować poziom ozonu w otoczeniu, aby zapobiec degradacji barwnika Cy5.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Dlaczego izolacja zmiennych niezależnych jest ważna w eksperymentach array CGH?
Izolacja próbek DNA testowych i referencyjnych gwarantuje, że obserwowane stosunki sygnałów odzwierciedlają rzeczywiste różnice genomiczne, a nie zmienność techniczną, co jest kluczowe dla dokładnej walidacji celu w procesach odkrywania.
W jaki sposób ilościowy pomiar zmiennej zależnej umożliwia analizę liczby kopii?
Stosunek log2 intensywności sygnału między DNA znakowanym Cy3 a Cy5 dla każdego celu BAC zapewnia ilościowy odczyt przyrostu lub utraty, umożliwiając obiektywną ocenę zmian genomowych w obrębie całego genomu.
Dlaczego wymagania dotyczące replikacji są istotne dla współpracy międzyfunkcyjnej w przypadku array CGH?
Powtórne nanoszenie klonów BAC na matrycę zwiększa niezawodność pomiarów, co pozwala zespołom polegać na spójności danych podczas przenoszenia wyników między grupami badawczymi zajmującymi się odkryciami, badaniami przedklinicznymi i translacyjnymi.
Jakie możliwości analizy statystycznej są wymagane przed wdrożeniem array CGH w procesie odkrywczym?
Zespoły muszą mieć możliwość przetwarzania i wizualizacji danych dotyczących stosunku log2 przy użyciu narzędzi takich jak SeeGH w celu zidentyfikowania istotnych odchyleń od poziomu bazowego, co umożliwia pewną interpretację zdarzeń związanych z liczbą kopii bez konieczności posiadania zaawansowanej wiedzy z zakresu bioinformatyki.
Dlaczego testowanie hipotezy zerowej jest istotne dla walidacji celu przy użyciu array CGH?
Zastosowanie progów statystycznych do stosunków log2 pomaga odróżnić rzeczywiste zmiany liczby kopii od szumu, co zapewnia, że tylko biologicznie istotne zmiany genomiczne są analizowane jako potencjalne cele terapeutyczne.
