Avaliação da Distribuição Espacial da γH2AX seguintes Radiação Ionizante

Olá, eu sou Raja Ti, fazendo meu doutorado no Instituto Baker IDI de Doenças Cardíacas e Diabetes. Vou guiá-lo pelos passos envolvidos na ilustração tridimensional da modificação de Eastern que marcou o dano ao DNA e a condensação cromática em uma nova célula cardíaca. O DNA está enrolado ao redor das zonas nucleares.

Cada nucleossomo é composto por quatro tipos diferentes de histonas: H dois A, H dois B, H três e H quatro radi. A formação de quebras no DNA é marcada pelo PHO da H dois X. Esse PHO da H dois X ocorre principalmente em regiões cripticas que são marcadas pela metilação da H três K quatro. Agora, examinaremos a ilustração tridimensional das modificações em sua célula, imunomarcada com a camada PHO da H dois X e a H três K quatro metilada.

Vamos começar. Iniciamos colocando o curso E da suspensão celular em tubos Falcon de 15 ml. Os tubos são lavados duas vezes com PB centrigação a 150 G e ressus.

Suspenda em meio fresco para observar o efeito imediato da radiação sobre eventos celulares. Mantenha as células sob observação por cinco a dez minutos antes e durante a radiação. Exponha as células à radiação gama ou raios X. Após a radiação, distribua três mililitros da suspensão celular em cada GU de seis.

Placa de poços para pico de gama H2AX: incubar as células entre 30 minutos e uma hora a 37 graus centígrados. Utilizamos a citospin para depositar as células não aderentes em lâminas de vidro. Ao montar o clipe de citospin, certifique-se de que todo o cordão do filtro coincida com o funil.

Dispense um volume de 50 microlitros, espalhe esta suspensão celular em cada posição final de citosina, coloque as lâminas de citosina na missão de citosina e centrifugue a 500 RPM durante cinco minutos. Remova as lâminas de citosina e separe as lâminas do cartão filtro. Não deixe as células secarem ao ar por muito tempo, pois isso pode influenciar o fundo na coloração com fluoresceína.

Usando um pino bloqueador de líquido, desenhe círculos ao redor de cada esfregaço; em seguida, fixe as células com paraformaldeído a 4% à temperatura ambiente por cinco minutos. Em comparação com etanol ou ol, uma fixação melhor foi observada com paraformaldeído a 4%. Incube as lâminas com PBS contendo células permeabilizadas com Triton X-100 à temperatura ambiente por cinco minutos.

Em comparação ao twin 80, observamos um sinal melhor nas células per com Triton X 100. Observe as células com PP S3 vezes cada uma por cinco minutos. Bloqueie as células em BSA de uma pessoa por 10 minutos à temperatura ambiente e repita este procedimento três vezes quando comparado a outros agentes e tempos de bloqueio.

A BSA foi a mais eficiente na minimização da ligação não específica de anticorpos primários; utilizamos dois anticorpos primários diluídos na proporção de um para 500 com 1% de BSA, aplicando aproximadamente 50 microlitros de anticorpo primário em cada lâmina. A incubação do anticorpo primário à temperatura ambiente por 60 minutos reduz a coloração de fundo em comparação com a incubação durante a noite a quatro graus centígrados. Lave as células três vezes com PBS durante cinco minutos cada lavagem.

Alexa floor 4 88, boa atividade anti-murino e Alexa floor 5 46 com atividade anti-coelho. Anticorpos secundários foram utilizados para detectar diferentes marcadores simultaneamente. Utilize anticorpos produzidos em espécies diferentes.

Adicione aproximadamente 50 microlitros do anticorpo secundário diluído a cada lâmina. Incube as células à temperatura ambiente por 90 minutos. Recomenda-se incubar as células em uma câmara úmida, pois isso evitará que as células e o anticorpo sequem; lave as lâminas com PBS três vezes, cada vez por cinco minutos.

Adicionou-se 50 microlitros de uma diluição de um para 500 de topo três em PBS a cada lâmina. Lave as lâminas com PBS três vezes, cada vez por cinco minutos. Remova o excesso de umidade das lâminas e adicione a solução Antifa.

Recomenda-se não secar completamente as células antes de adicionar a solução Antifa. Coloque uma lamínula sobre a lâmina. Deve-se ter cuidado para evitar a formação de bolhas de ar.

Deixe as lâminas durante a noite em uma câmara úmida e escura. Sobreponha a lâmina com esmalte para unhas para evitar a secagem das células. As imagens adquiridas em um microscópio confocal revelam.

Resoluções espaciais melhores foram perdidas e um laser de hélio foi utilizado para a aquisição da imagem. Uma objetiva de imersão a óleo de 63 é preferida em relação a lentes de maior ou menor aumento. Um fator de zoom de três ou quatro produzirá uma imagem com melhor resolução.

Para a aquisição de imagens de muitas células, é preferível utilizar uma velocidade de varredura de oito e um tamanho de imagem de 1024 por 1024 pixels por célula. Ao realizar imagens com múltiplos canais, recomenda-se a aquisição por varredura sequencial de linhas em vez da varredura de quadros. Para evitar o desbotamento da amostra, o ganho do detector e o deslocamento do amplificador são ajustados para reduzir o ruído e a saturação do sinal.

Como o tamanho do Kama HX X quatro pode ser inferior a 0,5 micrômetros, recomenda-se adquirir imagens com resolução de pelo menos 0,5 micrômetro. É necessário obter imagens com passo ao longo do eixo do jato em um padrão de série de jatos, utilizando o padrão marcar primeiro e marcar perdido. Para ilustrar a relação espacial entre diferentes proteínas, recomenda-se utilizar uma velocidade de varredura de seis com tamanho de imagem de 2048 e 248 pixels, usando o metamor primeiro.

O segundo pode ser contado a partir de imagens adquiridas em diversos microscópios confocais. Abra as tags de imagem gamma hgx diretamente no menu de arquivo ou utilizando números de identificação. Vá ao menu processar e escolha aritmética de pilha.

Escolha a projeção máxima e selecione os planos a serem incluídos. E clique em ok. Agora escolha top hat e selecione a imagem Gamma H2AX como imagem de origem para aplicar.

O filtro top hat e a imagem resultante serão uma imagem binária com menos ruído e variação reduzida na intensidade dos focos. Vá até regiões e selecione a ferramenta de desenho de região, desenhando regiões ao redor dos núcleos. Vá ao menu processar e selecione a opção de limiarizar imagem.

Escolha o limiar de inclusão e defina os valores de limiar inferior e superior. Geralmente, são os valores de limiar que afetam os quatro números. O valor de limiar ideal é aquele que minimiza a inclusão do fundo e maximiza a inclusão da invasão.

Isso pode ser melhor alcançado contando o número de incursões utilizando diferentes valores de limite. Em seguida, compare o número de incursões com a contagem a olho nu. Selecione a imagem DPI e vá ao menu de regiões e escolha a opção transferir regiões.

Agora temos imagens correspondentes de hifas e núcleos prontas para contagem. A maioria das regiões nucleares é transferida para top hat. Vá ao menu Medir e selecione a análise de área integrada ou IMA, selecione Medir todas as regiões e clique em Medir para obter o número de FTE.

Agora, os números de FTE de cada região podem ser exportados para uma planilha usando a opção de dados de log. Abra as imagens do projetor de jato criadas anteriormente para cada canal. Vá até exibição e selecione alinhamento de cores.

Selecione as imagens de origem respectivas para cada canal para criar uma imagem para os três canais. A análise de varredura em linha é realizada para ilustrar o posicionamento espacial dos diferentes marcadores no núcleo. Acesse o comando das barras de ferramentas de medição e selecione a análise de varredura em linha, traçando uma linha através da célula.

Isso criará um gráfico mostrando a intensidade fluorescente de cada canal ao longo da linha e representará a distância entre diferentes marcadores em relação uns aos outros. Para criar uma imagem 3D a partir de uma pilha, vá ao menu de pilha e escolha a reconstrução 3D. Selecione o tipo de reconstrução 3D máximo.

Escolha o plano de rotação, escolha a distância de calibração do jato. Normalmente, o usuário especifica e clica em OK para criar uma reconstrução 3D. E isso conclui nosso protocolo de imunofluorescência, coloração e análise de imagem.

Em resumo, o microscópio confocal de imunofluorescência é uma técnica para a visualização tridimensional de diferentes marcadores C e gama H dois X foy no núcleo celular. Obrigado por assistir.