Microarrays de DNA: Controle de Qualidade da amostra, Hibridação Array e Digitalização

O objetivo geral deste procedimento é realizar um experimento de microarranjo utilizando um aparelho misturador automatizado. Isso é realizado primeiramente analisando a qualidade das amostras de RNA com o bioanalisador após a amplificação e marcação do RNA. As amostras de RNA são hibridizadas aos microarranjos.

Por fim, as micromatrizes hibridizadas são lavadas e escaneadas. Em última análise, são obtidos resultados que mostram a expressão diferencial de transcritos de RNA por meio da análise de imagens de micromatrizes de fluorescência de dupla cor. A demonstração visual deste método é essencial, pois as etapas de hibridização da micromatriz são difíceis de aprender devido ao equipamento especializado.

A análise de controle de qualidade inicia-se com o preparo do instrumento bioanalisador 2,100 e da estação de cebamento do chip conforme indicado no procedimento escrito. Em seguida, a matriz de gel é filtrada pipetando 550 microlitros em um filtro de centrifugação fornecido com o kit RNA 6,000 nano. A centrifugação é realizada a 1.500 RCF por 10 minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, alíquotar o gel filtrado em alíquotas de 65 microlitros, que podem ser armazenadas a quatro graus Celsius por até um mês. Vortexar o concentrado de corante por 10 segundos e adicionar um microlitro a uma alíquota de 65 microlitros. Após vortexar a mistura, centrifugar o gel filtrado a 13.000 RCF por 10 minutos à temperatura ambiente para executar as amostras.

Primeiro, posicione um chip na estação de cebamento. Nesta demonstração, são utilizados chips RNA 6,000 nano. Carregue nove microlitros da mistura de corante em gel no poço marcado com um G branco sobre fundo preto.

Com a ponta da pipeta posicionada na parte inferior do poço, posicione o êmbolo da seringa em um mililitro e feche a estação de escorvamento. Pressione o êmbolo lentamente, mas com firmeza, até que seja travado pelo clipe.

Após 30 segundos, solte o clipe e permita que o êmbolo suba por alguns segundos. Depois que o êmbolo parar, puxe-o novamente até a posição de um mililitro e abra a estação de escorvamento. Carregue nove microlitros do corante para gel.

Misture em cada um dos dois poços. Marque G. Em seguida, pipete cinco microlitros do marcador no poço da escada e em cada um dos 12 poços de amostra. Em seguida, carregue um microlitro da escada desnaturada no poço da escada e um microlitro de cada amostra desnaturada nos poços de amostra.

Por fim, adicione um microlitro do marcador em cada amostra não utilizada. Após o carregamento, vortexe o chip por um minuto a 2.400 RPM. Após iniciar o software 2.100 expert, posicione o chip e feche a tampa.

Certifique-se de que a porta correta está selecionada e execute o ensaio dentro de cinco minutos após o carregamento das amostras para evitar evaporação. Os métodos para realização da amplificação e rotulagem de RNA podem ser encontrados no protocolo escrito. Após o rotulagem, purifique o cRNA para remover quaisquer nucleotídeos não incorporados. Utilizando colunas mini fáceis da Cogens, o cRNA rotulado pode então ser quantificado com um espectrofotômetro NanoDrop 2000.

No modo de medição de microarranjo, registre a concentração da amostra, o rendimento e a atividade específica. Para a hibridização de microarranjo, é necessário obter um rendimento de pelo menos 825 nanogramas e uma atividade específica de pelo menos oito picomoles por micrograma pelo menos duas horas antes da hibridização de microarranjo. Ligue a estação de hibridização e ajuste-a para 65 graus Celsius.

Este protocolo descreve o uso de matrizes Agilent quatro por 40 4K com o sistema de hibridização Roche nimble gen e uma câmara de mistura quádrupla subsequente à fragmentação de CRNA realizada conforme descrito no protocolo escrito, prepare a câmara de hibridização. Coloque uma lâmina de microarray na ferramenta de montagem e desmontagem com o lado do código de barras voltado para cima. Primeiro, abra um misturador A e exponha o adesivo que fixa a matriz e a ferramenta de montagem e desmontagem para evitar qualquer movimento.

Coloque o misturador A four no lâmina começando pela extremidade distante. Certifique-se de que está corretamente alinhado com a ferramenta e adira o misturador ao longo da matriz. Deslize a partir da extremidade do misturador para remover o conjunto do misturador e lâmina.

Usando a ferramenta de alisamento, pressione ao longo de toda a junta adesiva para garantir que ela esteja firmemente colada à lâmina. Pequenas bolhas de ar aprisionadas entre o adesivo e a lâmina podem ser vistas contra o fundo escuro. Dedique tempo adicional para remover essas bolhas com a ferramenta de alisamento.

A matriz agora está pronta para ser carregada. Utilize uma pipeta de deslocamento positivo para carregar 100 microlitros da amostra de hibridização. Insira bem firmemente a ponteira dentro da janela e libere lentamente e com suavidade, para que o ar não fique aprisionado na área da matriz.

Quando a amostra cobrir toda a matriz e o líquido começar a sair rapidamente pelo orifício de ventilação, remova a pipeta, liberando apenas o êmbolo. Uma vez que a ponta esteja afastada do lâmina, absorva suavemente o excesso de líquido em ambas as portas, tomando cuidado para não retirar a amostra da câmara propriamente dita. Em seguida, cubra os orifícios com adesivos utilizando pinças.

Coloque a lâmina na estação de hibridização e verifique se os orifícios das bolsas estão corretamente posicionados sobre as juntas O. Isso garantirá uma mistura adequada durante a hibridização. Feche a tampa da lâmina e a tampa da estação.

Configure a estação no modo de mistura B e hibridize a matriz a 65 graus Celsius por 17 horas. Após a conclusão, encha um recipiente de vidro rotulado como A com o tampão de lavagem um; o recipiente deve ser grande o suficiente para acomodar a ferramenta de montagem e desmontagem e permitir alguma manobra. Todas as lavagens devem ser realizadas em vidraria, pois o plástico tende a liberar compostos, resultando em fundo elevado na matriz.

Coloque um suporte para lâminas e uma barra magnética em um recipiente de coloração. Rotulado como B, encha o recipiente com tampão de lavagem até cobrir o suporte e coloque o recipiente sobre uma placa de agitação à temperatura ambiente. Além disso, adicione uma barra magnética a um recipiente de coloração vazio rotulado como C e coloque sobre uma placa de agitação.

Remova a matriz da estação de hibridização e coloque-a na ferramenta de montagem e desmontagem. Mergulhe toda a montagem no recipiente A, segurando a ferramenta de montagem e desmontagem e a lâmina por lados opostos com uma mão. Remova cuidadosamente o mixer A quatro, tomando cuidado para não arranhar a área da matriz.

Coloque rapidamente a lâmina no suporte e no recipiente de coloração B. A exposição ao ar deve ser minimizada, pois o corante SCI cinco é sensível ao ozônio. Lave a apagagem por um minuto, agitando em velocidade média. Encha o recipiente de coloração C com o tampão de lavagem dois pré-aquecido.

Transfira as lâminas e lave por um minuto. Após a lavagem, remova lentamente a grade de lâminas do recipiente de coloração C para minimizar gotículas deixadas nas lâminas. Seque a lâmina centrifugando por dois minutos.

Em seguida, coloque a lâmina em um tubo cônico de 50 mililitros e encha com gás argônio, realizando imediatamente a leitura com o scanner GenePix 4.000 B da Molecular Devices para evitar a perda de sinal mostrada. Abaixo estão exemplos de quatro amostras de RNA isoladas do cérebro humano. A qualidade da amostra de tecido tumoral foi avaliada utilizando o Bioanalisador 2.100 com um chip RNA 6.000.

As setas sólidas e abertas indicam a posição das espécies de RNAr 18 S e 28 S, respectivamente. O número de integridade do RNA ou RIN é uma medida quantitativa da qualidade do RNA; amostras de RNA total de boa qualidade devem apresentar apenas dois picos principais quando analisadas em um bioanalisador para controle de qualidade, correspondentes às duas principais espécies de RNA ribossômico.

Alguma degradação de RNA aparecerá como uma mancha difusa antes do primeiro pico de RNA ribossômico e um pico significativamente menor para o 28 S-R-R-N-A severamente degradado. O RNA de baixa qualidade mostrará um pico amplo ou uma série de picos em tempos baixos de retenção. Enquanto isso, os dois picos de RNA ribossômico terão intensidade muito baixa ou não serão identificáveis em absoluto.

Matrizes de boa qualidade devem produzir um sinal alto em valores relativamente baixos de PMT. Espera-se que a maioria dos transcritos esteja presente em níveis semelhantes nas amostras experimental e de referência. Alterações generalizadas e acentuadas na expressão gênica provavelmente carecerão de significado biológico.

Portanto, a maior parte do arranjo deve parecer amarela, e não verde ou vermelha. Os sinais de boa qualidade também devem estar em uma faixa dinâmica tal que os histogramas de sinal se sobreponham completamente, como visto no gráfico de dispersão da imagem do arranjo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar um experimento de microarranjo utilizando um aparelho automatizado de hibridização.