Micro-Mecânica Caracterização do tecido pulmonar Usando Microscopia de Força Atômica

O objetivo geral do experimento a seguir é caracterizar o ambiente mecânico local do parênquima pulmonar em uma escala espacial relevante para as células residentes, mediante a medição direta das propriedades elásticas locais de tecido pulmonar fresco espelhado utilizando microindentação por microscopia de força atômica. Isso é alcançado cortando o tecido pulmonar de camundongo inflado com agarro com lâmina de barbear ou bisturi, para preparar tiras de parênquima pulmonar de cinco por cinco milímetros de comprimento e largura, e 400 micrômetros de espessura. Em seguida, tiras de tecido pulmonar não fixadas e não permeabilizadas são imunomarcadas, o que identifica áreas de interesse para a microindentação por MF.

Em seguida, é realizada uma microindentação por FM em tiras de tecido em PBS à temperatura ambiente. Para medir diretamente as propriedades elásticas locais do tecido pulmonar fresco, são obtidos resultados. Esses resultados mostram diferenças acentuadas na amplitude e distribuição da rigidez tecidual no parênquima pulmonar normal e fibrotizado, além de grandes variações espaciais na rigidez, particularmente dentro da amostra de pulmão fibrotizado.

Com base em mapas de rigidez extraídos de curvas de deslocamento forçado obtidas por meio de microindentação com microscópio de força. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como o estiramento de tiras de tecido, é que ela oferece uma resolução espacial sem precedentes, proporcionando uma perspectiva única sobre as variações em escala microscópica da rigidez tecidual. Essa medida pode ajudar a responder perguntas fundamentais, como a forma como a rigidez varia espacialmente dentro do tecido e qual a extensão e a escala espacial das alterações de rigidez na doença.

Processos que resultam na remodelação tecidual Para preparar tiras de tecido pulmonar, comece estabilizando a estrutura pulmonar para o corte, insuflando pulmões isolados de camundongo. Intratraquealmente com 50 mililitros por quilograma de peso corporal de agarose morna a 2%, de baixo ponto de gelificação, preparada em PBS, amarre a traqueia e resfrie os pulmões insuflados em um banho de PBS a quatro graus Celsius por 60 minutos. A agarose gelificará e endurecerá nos espaços aéreos, estabilizando suavemente a estrutura pulmonar. Durante este intervalo, utilizando uma lâmina ou bisturi, corte o tecido pulmonar de camundongo estabilizado com agarose em tiras de aproximadamente cinco por cinco milímetros de comprimento e largura, e 400 micrômetros de espessura.

Em seguida, lave as tiras em PBS a 37 graus Celsius por cinco minutos para remover resíduos de aros, a fim de excluir vias aéreas e vasos grandes. Corte tiras das regiões subpleurais distantes dos brônquios principais se as vias aéreas e vasos grandes devem ser visualizados; corte tiras do tecido pulmonar mais próximo dos brônquios principais para isolar áreas de interesse para microindentação por MF. Visualize o tecido por microscopia de contraste de fase ou imunomarcação e visualize por microscopia de fluorescência.

Consulte a parte escrita deste protocolo para o procedimento. Imediatamente antes de uma caracterização por FM, fixe as tiras de tecido em lamínulas de 15 milímetros revestidas com poli-L-lisina elevando a lamínula a partir de baixo do tecido flutuante, certificando-se de que a tira de tecido se espalhe uniformemente sobre a superfície da lamínula. Se necessário, coloque a tira entre uma segunda lamínula limpa e não revestida e aplique pressão suave para auxiliar na adesão do tecido à lamínula revestida com poli-L-lisina.

Calibre o sistema de FM-A seguindo as instruções do fabricante imediatamente antes de cada rodada de experimentos de microindentação. Para isso, determine dois parâmetros críticos: a constante elástica da alavanca, utilizando o método de flutuação térmica no ar, e a sensibilidade de deflexão da alavanca, que é um parâmetro usado para converter o sinal de saída do fotodiodo na distância real de deflexão da alavanca.

Calibre a sensibilidade de deflexão obtendo uma curva padrão de deslocamento forçado em PBS sobre uma lâmina de vidro limpa. Em seguida, calcule a inclinação da curva de deslocamento forçado na medição da curva de deslocamento forçado. A ponta de FM é estendida e retratada em relação à superfície da amostra em uma única localização, com a deflexão da alavanca delta D monitorada como função do deslocamento da ponta delta Z. Recomenda-se o uso de uma alavanca triangular de nitreto de silício com uma ponta esférica de borossilicato de cinco micrômetros de diâmetro, utilizando sondas de FM com uma constante elástica de 0,06 newtons por metro.

Caracterizamos mecanicamente materiais moles com módulo de cisalhamento variando de 100 a 50.000 pascals. Limpe a superfície inferior da lamínula da amostra com papel de tecido, em seguida fixe-a a uma lâmina de vidro comum usando graxa de vácuo. Monte a lâmina de vidro no estágio da amostra do microscópio de força atômica (AFM) e cubra o papel de tecido com 500 microlitros de PBS à temperatura ambiente.

Em seguida, posicione a cabeça de varredura de FM sobre a amostra. Ajuste o estágio da amostra do microscópio para configurar o microscópio para visualização pela ocular, alinhando a ponta de FM no centro do campo de visão. Mova o estágio da amostra de FM para escolher uma área de interesse no tecido.

Em seguida, mude para a visualização com câmera CCD para registrar imagens de contraste de fase e/ou imagens de fluorescência do tecido conforme desejado. Mova lentamente a ponta do AFM para baixo até que entre em contato preciso com a amostra. A caracterização por microindentação com AFM de amostras macias exige pequenas profundidades de indentação para evitar grandes deformações locais, o que inviabiliza o modelo de Hertz utilizado para o cálculo do módulo elástico; para evitar grandes deformações, realize a indentação no modo de disparo (trigger) ajustando a deflexão máxima da alavanca a 500 nanômetros.

Este limite de deflexão restringirá a força máxima de indentação a menos de 30 nano newtons. A velocidade de indentação deve ser selecionada suficientemente lenta para explorar as propriedades elásticas em vez das propriedades viscoelásticas da amostra macia. Selecione uma faixa de velocidade de dois a 20 micrômetros por segundo para tecido pulmonar em uma única medição a partir de uma área de interesse.

Mova a sonda A FM até a localização de interesse e realize uma única indentação para coletar uma curva padrão de força-deslocamento. A sonda se moverá apenas na direção Z. Para mapeamento automatizado de uma região de interesse, mude para o modo de mapa de força, selecione o tamanho da varredura e os pontos de amostragem dentro da área selecionada.

A ponta de FM varre a superfície da amostra entre os movimentos de indentação e coleta curvas individuais de força versus deslocamento em cada ponto de uma grade definida de amostra. Achamos prático usar uma grade de amostra de 16 por 16 para mapear uma área de 80 micrômetros por 80 micrômetros com uma velocidade de indentação de 20 micrômetros por segundo, o que pode ser concluído em cerca de 10 minutos. Para calcular o módulo de Young, ajuste a curva de força versus deslocamento ao modelo de indentação esférica de Hertz usando o método de ajuste não linear de mínimos quadrados, conforme mostrado aqui, onde F é igual a K sub C vezes delta D, sendo a força necessária para flexionar a alavanca.

K sub C é a constante elástica da alavanca. R é o raio da ponta esférica, delta igual a delta Z menos delta D é a indentação, e ν é a razão de Poisson da amostra, que equivale a 0,4 para tecido pulmonar. Para avaliar a qualidade do ajuste, calcule o valor SSR ou a soma dos quadrados da diferença entre os dados e os valores ajustados durante o ajuste não linear da curva.

Elimine medições pouco confiáveis ou não interpretáveis descartando dados de curvas ruins com valores elevados de SSR. Se desejado, converta o módulo elástico ou E em módulo de cisalhamento G, utilizando a relação E igual a duas vezes a soma de um mais ν vezes G. Para visualizar os padrões espaciais de rigidez coletados no modo de mapa de força, plote os dados do módulo e mapas de contorno, por exemplo, em uma grade 16 por 16 que cubra uma área de 80 micrômetros por 80 micrômetros.

Para processar uma grande quantidade de dados de curvas de força, pode-se escrever um algoritmo personalizado para ajustar automaticamente as curvas de força versus deslocamento, extrair módulos e/ou plotar mapas de contorno ou enxertos ELA. Usando os mesmos procedimentos e parâmetros descritos acima, esta figura mostra que o tecido foi corretamente cortado e corado. A microestrutura alveolar do parênquima pulmonar está bem preservada, conforme observado por coloração de imunofluorescência para o componente da membrana basal, laminina, sem fixação ou permeabilização.

Estes painéis mostram a coloração por imunofluorescência para colágeno, uma em pulmões frescos não fixados obtidos de camundongos previamente tratados com PBS ou com bleomicina para induzir fibrose. Gráficos de força-deslocamento obtidos a partir de uma microindentação por FM são mostrados aqui com a mesma força aplicada. A ponteira de FM gera uma grande indentação em uma região macia, resultando em uma curva de força-deslocamento relativamente plana, mostrada em azul, versus uma pequena indentação e uma curva de força-deslocamento acentuada para uma região mais rígida, mostrada em vermelho.

Para obter curvas de força limpas após cada indentação, a ponta do microscópio de força atômica (AFM) precisa ser recolhida completamente da superfície da amostra e ficar livre de contato antes da próxima indentação. Esse estado sem contato corresponde à região plana da curva, onde a ponta se desloca sem deflexão do cantiléver. Esta figura mostra uma curva típica incorreta, sem uma região plana, que ocorre quando a ponta não é completamente recolhida da superfície da amostra, como no caso em que uma amostra mole adere à ponta, tornando impossível determinar o ponto de contato se a ponta ficar completamente presa na amostra mole.

A curva pode parecer assim, sem desvio claro, mas com pequeno ruído. Esta figura mostra a rigidez. Os dados extraídos de curvas de deslocamento forçado exibidos espacialmente como mapas de rigidez referem-se ao enxerto de ELAs, onde a escala de cores varia conforme a rigidez. Os enxertos de ELAs demonstram diferenças acentuadas na amplitude e distribuição da rigidez tecidual no parênquima pulmonar normal e fibrotico, além de grandes variações espaciais na rigidez, particularmente dentro da amostra pulmonar fibrotica.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como caracterizar o ambiente mecânico local do parênquima pulmonar mediante a medição direta das propriedades elásticas locais de tecido pulmonar fresco utilizando microscopia de força atômica.