Rastreamento de celular utilizando proteínas Photoconvertible Durante o Desenvolvimento Zebrafish

O objetivo geral deste procedimento é rastrear células fotoativadas em um embrião de peixe-zebra vivo. Isso é realizado primeiramente incorporando um embrião que expressa uma proteína fluorescente conversível por luz, específica para um tecido, em agarose de baixa temperatura de fusão. Em seguida, a proteína dentro da região de interesse é completamente convertida pela luz.

Em seguida, o embrião é cuidadosamente removido do agarose e mantido em água de ovo a 28,5 graus Celsius até estágios posteriores. Por fim, o embrião fotoconvertido é novamente embutido em agarose de baixa temperatura de fusão. Em última análise, podem-se obter resultados que demonstram que as células fotoconvertidas podem ser precisamente detectadas em estágios posteriores devido à presença estável da proteína fotoconvertida por meio de microscopia confocal.

Portanto, acreditamos que o método que apresentaremos hoje será bastante útil no contexto da biologia celular e do desenvolvimento. Achamos que o uso dessa metodologia no estudo da migração celular, da dinâmica tecidual e de outros comportamentos celulares será muito proveitoso. O procedimento será demonstrado por Veronica Lombardo, pós-doutoranda do meu laboratório, após o cruzamento de peixes-zebra transgênicos que expressam uma proteína fluorescente fotoconvertível.

Escolha os embriões mais brilhantes, que sejam homozigotos, e cultive-os a 28,5 graus Celsius quando atingirem o estágio desejado. Use pinças para desencapsular os embriões em um recipiente de vidro com água de ovo para anestesiá-los. Utilize uma pipeta de vidro ou uma ponteira cortada para transferi-los, um a um, para a trica.

Transfira um embrião anestesiado para a tampa de uma placa de cultura e mantenha o embrião no menor volume possível de meio. Transfira o embrião para agros adicionando-o com agros a 1% de baixa temperatura de fusão com trica a 30 graus Celsius e coloque-o em uma placa de cultura com fundo de lamínula de vidro. Utilize uma ponteira plástica lisa para orientar o embrião assim que o agros tiver polimerizado.

Cubra com a solução Trica em um microscópio confocal invertido equipado com fontes a laser de 405, 488 e 561 nanômetros e objetiva de 20x. Utilize os lasers de 488 e 561 nanômetros para gerar um empilhamento Z de toda a estrutura do espécime, que inclui a região de interesse. Selecione a ferramenta de série temporal e configure para dois ciclos sem intervalo, um para pré e outro para pós-conversão fotônica.

Selecione a ferramenta da região e defina uma ou mais regiões de interesse para a conversão fotográfica. Em seguida, selecione a ferramenta de branqueamento e configure para iniciar o branqueamento após a varredura. Um dos dois utilizados aqui é um laser de diodo de 30 miliwatts e 405 nanômetros.

Otimizado cuidadosamente para a quantidade mínima de luz laser necessária para a conversão fotográfica completa, o que é alcançado variando a intensidade da luz laser, o número de varreduras da região de interesse e a velocidade de varredura. Varra a amostra com os lasers de 488 nanômetros e 561 nanômetros para visualizar qualquer fluorescência verde remanescente e a fluorescência vermelha convertida pela luz da proteína fluorescente conversível por luz. Após a conversão fotográfica, descarte a solução e, utilizando uma agulha ou ponta de plástico lisa, remova cuidadosamente o embrião do agros.

Mantenha o embrião em água de ovo no escuro a 28,5 graus Celsius até o estágio de desenvolvimento desejado. Incorpore o embrião uma segunda vez, então gere um Zack do espécime, incluindo a região de interesse, utilizando novamente os lasers de 488 e 561 nanômetros. Como este protocolo não afeta o desenvolvimento normal, é possível observar o embrião fotoconvertido em estágios posteriores.

Aqui está um exemplo de um ensaio de conversão fotônica. Células endoteliais foram rastreadas durante o desenvolvimento de peixe-zebra de 48 a 72 horas após a fertilização, utilizando uma linhagem transgênica que expressa kick G nos núcleos endoteliais, conforme mostrado aqui antes da conversão fotônica. O kick G era expresso no tecido endotelial e era detectável apenas como fluorescência verde usando varreduras de controle com laser de argônio de 488 nanômetros. Não foi detectada qualquer kick GR convertida por fotoconversão antes do procedimento de conversão fotônica.

Posteriormente, a região de interesse foi completamente fotoconvertida utilizando um laser de diodo de 405 nanômetros com intensidade de 10%, 20 iterações, e os vasos da cabeça foram escaneados novamente usando os lasers de 488 nanômetros e 561 nanômetros. Neste painel, o sinal verde G foi completamente convertido para vermelho dentro da região de interesse, permitindo acompanhar as células endoteliais fotoconvertidas em estágios posteriores. O embrião foi observado 24 horas após a fotoconversão, o que corresponde a aproximadamente 72 horas após a fertilização, em tecidos endoteliais derivados da região de interesse fotoconvertida.

Foram observadas tanto as proteínas G kick não convertidas quanto as convertidas pela luz, devido à estabilidade da proteína G kick vermelha fluorescente convertida pela luz e à síntese de nova proteína G kick verde não convertida após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de biologia do desenvolvimento explorarem a biologia celular e a remodelação de tecidos em diversos peixes.