O método MODS para o diagnóstico da tuberculose e da tuberculose resistente a múltiplas drogas

Para cada três pessoas no mundo, uma está infectada com tuberculose. Diagnosticar a tuberculose ativa previne novas infecções, porque pacientes com tuberculose ativa infectarão entre 10 e 15 outras pessoas por ano até o momento em que forem tratados ou venham a óbito. MODS é um acrônimo que utilizamos para evitar a necessidade de dizer observação microscópica, teste de suscetibilidade a medicamentos, e o motivo pelo qual é chamado assim se tornará evidente à medida que a metodologia for explicada.

No breve vídeo, descreveremos a metodologia MODS para o diagnóstico rápido e de baixo custo da tuberculose e da tuberculose multirresistente. O vídeo apresentará a metodologia passo a passo. Discutiremos as implicações de biossegurança do trabalho com culturas líquidas e também explicaremos algumas questões importantes de controle de qualidade necessárias para o uso desta metodologia.

O ensaio MODS foi desenvolvido na Universidade Kayana, em Lima, Peru, no laboratório de Bob Gilman. Após observações inicialmente feitas por Loose Cavi, LOOSE tentava identificar métodos rápidos para detectar Mycobacterium tuberculosis em culturas utilizando indicadores colorimétricos.

Mas ela observou que a observação dessas culturas ao microscópio revelou a presença de crescimento de microbactérias vários dias antes das mudanças de cor dos indicadores colorimétricos, e foi com base nessa observação que o ensaio MOD foi desenvolvido. O ensaio MOD foi criado em um ambiente com recursos limitados e é direcionado a ambientes com recursos limitados, custando, portanto, pouco menos de 3 dólares por teste para a detecção de tuberculose com base em cultura líquida e detecção de resistência múltipla a medicamentos. É extremamente atrativo e, pela primeira vez, traz esse tipo de capacidade diagnóstica para locais onde os recursos são limitados.

Assim, o ensaio MODS baseia-se em três princípios centrais. O primeiro é que Mycobacterium tuberculosis cresce em meios líquidos muito mais rapidamente do que em meios sólidos. Este é um fato conhecido há muitos anos.

Em segundo lugar, se observarmos esses meios líquidos ao microscópio, podemos detectar o crescimento de *M. tuberculosis* muito mais rapidamente do que esperar pelo aparecimento macroscópico de colônias em meios sólidos. E, de fato, esse crescimento é totalmente característico, permitindo-nos distinguir *M. tuberculosis* em meios líquidos de contaminações bacterianas ou fúngicas, ou mesmo do crescimento de micobactérias atípicas não tuberculosas que possam estar presentes. Por fim, e talvez isso seja a coisa mais empolgante sobre o ensaio MODS, é que podemos incorporar medicamentos como a rifampicina e, portanto, detectar diretamente a resistência múltipla a fármacos a partir do escarro.

Ao usar essas drogas no início do ensaio, podemos detectar tanto a tuberculose quanto, ao mesmo tempo, se o isolado é resistente ou não a essas duas drogas. Isso elimina a necessidade de subcultura e de realizar um teste indireto de suscetibilidade a medicamentos. Agora, vamos simplesmente descrever o equipamento necessário para realizar o ensaio MODS.

Uma geladeira é necessária para armazenar o meio preparado. Uma balança é necessária para pesar o IS e a Rifampicina. Um vórtex é necessário para a mistura do escarro.

Com a solução de descontaminação, é necessário um centrifugador para concentrar a amostra de escarro descontaminada, e este deve ser capaz de atingir 3000 G. O centrifugador não precisa ser refrigerado, mas é absolutamente essencial que seja seguro para biossegurança e atenda aos requisitos de biossegurança. Para trabalhos com micobactérias, é necessário que os recipientes do centrifugador possam ser vedados com tampas traváveis. É necessário um incubador capaz de atingir e manter 37 graus centígrados.

Isso não precisa ser enriquecido com CO₂. É necessário um microscópio invertido para ler as placas mods, que deve ter objetivas de quatro x e 10 x, e uma autoclave é necessária para esterilizar o meio de cultura e também para a eliminação de culturas microbacterianas. Microtubos são necessários para alíquotas no meio, bem como uma cabine de segurança biológica. Uma classe dois é necessária para procedimentos que envolvam manipulação de amostras de escarro e inoculação de placas.

Os reagentes necessários para realizar o ensaio mods são os seguintes: meio Middlebrook 7H9, casitone e glicerol, PANTA (suplemento antibiótico) e OADC. Os estoques de suplementos nutricionais dos antibióticos incluem isoniazida e rifampicina, dimetilsulfóxido (DMSO) para preparação da rifampicina, hidróxido de sódio, citrato de sódio e N-acetilcisteína para descontaminação de escarro, dihidrogenofosfato de sódio e monofosfato de potássio para preparação do tampão fosfato, hipoclorito de sódio a 10% para descarte de resíduos infectados e desinfetante para limpeza das superfícies de trabalho. Também são necessários os seguintes plásticos e consumíveis: tubos de vidro estéreis, filtros de 0,2 micrômetros para solventes aquosos e filtros de 0,2 micrômetros para solventes orgânicos, tubos de microcentrífuga, tubos cónicos de 15 mL, tubos estéreis de 50 mL e 10 mL, pipetas serológicas, ponteiras estéreis para micropipetas, placas de cultura tecidual de 24 poços e sacos plásticos seláveis do tipo Ziploc, nos quais as placas de 24 poços são colocadas após a inoculação da amostra de escarro no meio.

Existem quatro grupos de soluções estoque que podem ser preparados com antecedência. A solução de tampão fosfato é composta por uma combinação das soluções de fosfato de sódio, diba e fosfato monobásico de potássio, ajustadas a um pH de 6,8 ± 0,2. Esta solução é autoclavada a 121 a 124 graus centígrados por 15 minutos para esterilização, e uma alíquota é cultivada em ágar nutriente para confirmar a esterilidade.

Isso pode ser armazenado na geladeira a dois a oito graus centígrados por até um mês. Cada amostra de escarro requer 10 mililitros de solução tampão fosfato. A solução estoque para descontaminação de escarro é uma combinação de hidróxido de sódio e citrato de sódio.

Essas soluções são combinadas em volumes iguais e autoclavadas a 121 a 124 graus centígrados por 15 minutos e também podem ser armazenadas na geladeira a dois a oito graus centígrados por até um mês. São necessários dois mililitros dessa solução para cada amostra de escarro. O meio de cultura básico é composto por Middlebrook 7H9 com casitone e glicerol.

O pó de H nove sete é dissolvido em água destilada estéril contendo glicerol e cascione e misturado com agitação constante até completa dissolução. Este meio é autoclavado a 121 a 124 graus centígrados por 15 minutos e, após o resfriamento, é dividido em alíquotas de 4,5 mililitros em tubos de vidro estéreis de 16 por 100 milímetros. O meio é incubado a 37 graus por 48 horas para verificar a esterilidade, indicada pela ausência de turvação após esse período, e pode ser armazenado de dois a oito graus centígrados com a tampa bem fechada por até um mês.

Cada amostra de escarro requer um tubo contendo 4,5 mililitros deste meio de cultura. As soluções estoque de antibióticos são preparadas da seguinte forma: dissolver completamente em água destilada estéril e filtrar com um filtro de seringa de 0,2 micrômetro para solventes aquosos. Alíquotas de 20 microlitros podem então ser armazenadas em tubos estéreis de microcentrífuga a menos 20 graus centígrados por até seis meses; cada alíquota de 20 microlitros é suficiente para até cem amostras.

Soluções estoque de rifampicina de oito miligramas por mililitro são preparadas dissolvendo-se rifampicina em DMSO e água destilada estéril. Essa mistura é filtrada com um filtro de seringa de 0,2 micrômetro para solventes orgânicos, e a solução pode ser armazenada em alíquotas de 20 microlitros em tubos estéreis de microcentrífuga a menos 20 graus centígrados por até seis meses. Cada alíquota de 20 microlitros é suficiente para até 100 amostras. Agora passamos à parte da metodologia propriamente dita e aos três passos que você precisa seguir no dia do procedimento.

Isso está convertendo as soluções estoque em soluções de trabalho. Primeiro temos a solução de descontaminação, depois temos a solução de meio. E finalmente, as soluções de trabalho das drogas isen e Rifampicina.

O método de descontaminação, utilizado para a metodologia mods, é a metodologia padronizada de descontaminação com hidróxido de sódio nalk. O nalk é um mucolítico, que ajuda a digerir o escarro e permite que o hidróxido de sódio realize a descontaminação. Para isso, precisamos da nossa solução estoque de hidróxido de sódio e citrato de sódio, e 0,1 gramas de NA são adicionados a 20 ml dessa solução.

Toda solução que não for utilizada no dia da preparação deve ser descartada. A preparação final do meio de cultura também deve ser realizada apenas no dia de uso. O meio H sete nove armazenado é combinado com OADC e Panta; 4,5 mililitros do meio são combinados com 0,5 mililitros de OADC e 0,1 mililitros de Panta em cada tubo.

Isso é suficiente para uma amostra. As soluções trabalhadoras de cada fármaco são preparadas no dia de uso, e quaisquer soluções não utilizadas devem ser descartadas, pois a atividade não pode ser garantida. Alíquotas armazenadas são diluídas em placas de cultura de tecidos com 24 poços serialmente com meio sete H nove oh A DC, de modo que a concentração final no poço, alcançada após a adição da amostra de escarro com meio, seja de 0,4 microgramas por mililitro de ácido fórico e 1 micrograma por mililitro de rifampicina.

Prosseguindo agora para o procedimento de descontaminação, duas mililitros de amostra de escarro são colocados em um tubo cônico tipo Falcon e então são adicionados dois mililitros da nossa solução descontaminante de hidróxido de sódio a 2%. A tampa é recolocada e firmemente rosqueada, após o que a suspensão é vortexada e deixada em repouso por 15 minutos, período durante o qual ocorre o processo de descontaminação. Após esse tempo, são adicionados 14 mililitros de solução tampão de fosfato.

A tampa é recolocada e aparafusada firmemente, e o tubo é colocado na centrífuga após 50 minutos a 3000 G; o sobrenadante S é decantado e o pellet que permanece é a amostra que desejamos semear utilizando os tubos de 5,1 mililitros de sete H nine OEDC panter. Nosso pellet é ressuspenso em um volume de aproximadamente dois mililitros. Metade dessa amostra ressuspensa é armazenada como reserva em um tubo de microcentrífuga.

Isso é então mantido disponível caso nossa cultura fique contaminada e precisemos semear a amostra novamente. O outro mililitro é adicionado aos sete restantes de H nine oh a DC panter que estão em nosso tubo de vidro, e esta é a nossa amostra pronta para ser semeada. 900 microlitros dessa suspensão de meio e amostra são colocados em cada um dos quatro poços em uma coluna de uma placa de 24 poços.

Os poços restantes da placa de 24 poços são preenchidos com amostras subsequentes de forma que cinco amostras preencham uma placa de 24 poços, uma para cada uma das cinco colunas, e a sexta coluna é deixada sem amostra. A sexta coluna serve como controle negativo para esta coluna. São colocados todos os constituintes do meio sem amostra de escarro e, claramente, qualquer crescimento nesta coluna indica que temos um problema de contaminação cruzada e toda a placa precisa ser descartada.

Toda placa que utilizamos exige uma coluna de controle negativo. Agora temos nossa placa contendo todas as nossas amostras e meio. Precisamos adicionar nossas suspensões de antibióticos em uma placa separada.

Preparamos nossas diluições conforme descrito anteriormente de Rifampicina e Isid, e com um multicanal de quatro canais, coletamos 100 microlitros de cada um desses poços e dispensamos 100 microlitros de sete H nove OADC em cada um dos dois poços controle e 100 microlitros de Rifampicina e 100 microlitros de isid em cada um dos dois poços contendo fármaco. Após a placa estar completa, a tampa é recolocada e ela é colocada dentro de um saco Ziploc; a partir desse momento, o saco não é mais aberto, e, portanto, quaisquer culturas que cresçam em meio líquido nunca terão a oportunidade de sair do saco.

Todas as leituras da placa a partir de agora são realizadas dentro do saco, e o saco é colocado em um saco para autoclave e descartado ao final do cultivo. Dessa forma, evitamos a manipulação de suspensões altamente concentradas de micobactérias. Vamos agora comentar brevemente sobre o controle de qualidade.

Existem controles de qualidade embutidos na metodologia mods, essenciais para o uso adequado do ensaio. Em primeiro lugar, há controles negativos, que são realizados em cada placa individual. Esses controles já foram mencionados anteriormente, mas, em resumo, temos uma coluna que contém todos os constituintes do meio de cultura, sem a presença de uma amostra de escarro, ao lado de outras cinco amostras de escarro em uma placa. Os poços da coluna devem ser examinados da mesma forma que qualquer outro poço, e a presença de qualquer crescimento nestes poços indica que houve contaminação cruzada, o que implica que nenhum dos resultados da placa pode ser considerado confiável.

Portanto, a placa deve ser descartada e todas as amostras devem ser replantadas. Além disso, existem controles internos que funcionam como controles positivos. Eles são analisados em uma placa separada, e essa placa é preparada após todas as outras placas de amostras terem sido preparadas, ao final do dia, para minimizar o risco de contaminação cruzada dentro do laboratório.

Neste placa separada, realizamos uma cepa totalmente suscetível de Mycobacterium tuberculosis e uma cepa resistente à isid e rifampicina. Caso haja preocupações quanto ao uso de uma cepa multirresistente em uma placa, pode-se utilizar uma cepa monorresistente à rifampicina em substituição a essas duas cepas suscetível e MDR. O objetivo dessas cepas é demonstrar não apenas que o meio permite o crescimento — portanto, todos os nossos controles positivos devem apresentar crescimento no poço sem droga —, mas também que as concentrações das drogas estão corretas; assim, os controles positivos suscetíveis não devem crescer na presença de is e rifampicina, enquanto os controles positivos resistentes devem, evidentemente, crescer nas concentrações de rifampicina e is presentes na placa.

Ok, agora vamos para a leitura das placas. Se considerarmos o dia do plaqueamento das nossas amostras como dia zero, a leitura das placas começa no dia cinco. Antes disso, o crescimento de micobactérias raramente é observado.

As placas são examinadas em um microscópio invertido de luz. Ou seja, as placas são examinadas de baixo para cima, o que nos permite visualizar muito claramente os cordões, enquanto a tentativa de visualizar as culturas de cima é prejudicada pela condensação na tampa das placas e também porque a distância focal não é adequada em um microscópio padrão. O exame microscópico é geralmente realizado com a objetiva de 10 x, considerando-se culturas positivas aquelas em que há pelo menos duas unidades formadoras de colônia em ambos os poços sem droga.

A presença de contaminação é facilmente reconhecida porque o meio fica turvo e, no quinto dia, geralmente há crescimento excessivo na maior parte do poço. Em contraste, o crescimento micobacteriano não provoca turvação do poço; o crescimento inicial das micobactérias forma estruturas pequenas semelhantes a vírgulas, que progressivamente avançam para formar cordões ou emaranhados característicos. Em duas semanas, um crescimento fortemente positivo apresentará conglomerações de micobactérias, com os cordões visíveis apenas nas extremidades.

A grande maioria das culturas que vão se tornar positivas já está positiva no dia 14, e por isso recomendamos leituras diárias do dia cinco ao dia 14 e, posteriormente, leituras a cada dois ou três dias, de acordo com a carga de trabalho do laboratório. No dia em que uma cultura estiver claramente positiva nas duas poças sem droga, as poças contendo droga devem ser lidas. Qualquer crescimento na presença de uma das drogas indica resistência àquela droga. É muito importante observar que, se a leitura das poças contendo droga for realizada mais de uma semana após a detecção de cultura positiva nas poças sem droga, isso pode não representar resistência, já que ocasionalmente é observado crescimento por escape.

As leituras podem ser interrompidas no dia 21 se uma cultura for negativa, já que culturas positivas após esse período nunca são encontradas em pacientes que não estão recebendo terapia. Após a conclusão de 21 dias de incubação, as culturas podem ser descartadas. As culturas permanecem dentro de suas bolsas Ziploc e são colocadas em bolsas para autoclave, sendo autoclavadas a 121 a 124 graus centígrados por 45 a 60 minutos, após o que podem ser descartadas com segurança. Vou dizer apenas algumas palavras agora sobre biossegurança e o ensaio mods, à medida que temos implementado o mods não apenas no Peru, mas também em contextos na África e na Ásia.

Uma questão recorrente surge quanto à segurança e à biossegurança do uso de culturas microbacterianas em meios líquidos. Este é um temor compreensível, pois obviamente os líquidos podem derramar e os meios sólidos não apresentam esse risco; além disso, existe o risco de aerosolização ao lidarmos com suspensões de micobactérias. É exatamente por essas razões que acreditamos que a metodologia mod é uma abordagem mais segura do que qualquer metodologia que exija testes indiretos de suscetibilidade a medicamentos.

A razão para isso é que, no teste de suscetibilidade indireto, prepara-se uma suspensão de microbactérias com concentração conhecida. Isso envolve, portanto, a manipulação de soluções altamente concentradas de microbactérias, com todos os riscos associados de derramamento e formação de aerossóis. Em contraste, a metodologia MODS, como você já pôde observar, simplesmente envolve a inoculação de uma amostra de escarro em nossa placa, após a qual a placa é selada dentro de um saco plástico.

Este saco nunca é aberto novamente, e, portanto, não precisamos lidar com essas suspensões altamente concentradas. Isso não quer dizer que acreditamos que a metodologia mod seja completamente segura; manipular micobactérias sempre envolve um risco. No entanto, dados da Coreia publicados em 2006 parecem ter confirmado nossa posição de que os mods não são mais perigosos do que o plaqueamento de qualquer outro cultivo.

Este foi um estudo realizado com trabalhadores de laboratório, que mostrou que os riscos ocupacionais para os trabalhadores que realizavam o plaqueamento de culturas e não tinham responsabilidade pelo teste de suscetibilidade a medicamentos não eram maiores do que para aqueles que realizam a microscopia direta de esfregaços de escarro. Em contraste, aqueles que manipulam suspensões de micobactérias e realizam testes de suscetibilidade a medicamentos apresentam taxas muito mais elevadas de risco ocupacional para tuberculose. É claramente de importância fundamental que todos os funcionários de laboratório sejam protegidos tanto quanto possível, e por isso recomendamos enfaticamente que nenhum desses procedimentos seja realizado sem proteção respiratória pessoal adequada, pela qual entendemos máscaras no padrão N95.

Além disso, é necessário um gabinete ou capela de segurança biológica classe dois, no qual todas as áreas de exaustão são filtradas por filtros HEPA. Por fim, um mecanismo simples, mas muito importante para evitar a turbulência do fluxo de ar dentro de um laboratório, é um travamento na porta do laboratório, impedindo a entrada e saída de pessoal enquanto as amostras estão sendo processadas. Isso reduz o risco de transmissão dentro do laboratório. Assim, espero que tenha fornecido uma boa visão geral do que envolve a metodologia MODS e de quão útil ela pode ser em contextos onde os recursos são limitados, mas diagnósticos de alta qualidade para tuberculose e tuberculose MDR são urgentemente necessários.

Para obter mais informações, você pode visitar nosso site, mods peru. org, onde encontrará nossos procedimentos operacionais padrão detalhados, o guia do usuário para mods. Além dos POPs para o processamento de amostras extrapulmonares, também dispomos de uma biblioteca de fotos de micobactérias e tuberculose, outras micobactérias e contaminações bacterianas e fúngicas, e você também poderá encontrar nossa estratégia de garantia de qualidade e o procedimento que recomendamos para acreditação de laboratórios para iniciar o uso do mods.

Por fim, há uma folha de perguntas frequentes, e damos as boas-vindas a qualquer feedback de usuários que estejam utilizando os mods atualmente, pois esta é uma metodologia iterativa. Como explicamos anteriormente, é um teste não proprietário e estamos sempre interessados em aprimoramentos que outros laboratórios tenham conseguido realizar.