Количественная оценка Дрожжи Lipidome использованием Электроспрей ионизации масс-спектрометрии

Данный протокол позволяет быстро проанализировать основные компоненты липидного пула дрожжей. Процедура начинается со сбора и промывки дрожжевых клеток. Промытые клетки помещают в смесь хлороформа и метанола в соотношении от 1:2 и лизируют с помощью стеклянных шариков.

Добавление хлороформа и воды приводит к разделению на две фазы. Органическую фазу собирают и высушивают, после чего липидную пленку растворяют в хлороформе для хранения перед масс-спектрометрией. Экстрагированные липиды разбавляют в хлороформе и метаноле с гидроксидом аммония, затем добавляют смесь внутренних стандартов.

Теперь раствор липидов можно ввести непосредственно в масс-спектрометр. Здравствуйте, я Саймон Борк из лаборатории Владимира Теко на кафедре биологии Университета Конкордия. Сегодня я продемонстрирую вам метод количественного определения липидов дрожжей с помощью масс-спектрометрии.

Мы используем данную процедуру в нашей лаборатории для изучения изменений липидов дрожжей при различных условиях роста. Итак, приступим. Чтобы начать выполнение процедуры, ресуспендируйте предварительно подготовленные замороженные пеллеты дрожжей в 1,6 миллилитрах ледяной дистиллированной воды и перенесите 1,6 миллилитра клеточной суспензии в высокоскоростные стеклянные центрифужные пробирки.

Обратите внимание, что на протяжении всей данной процедуры все манипуляции с экстрагированными липидами выполняются с использованием стеклянных пипеток или шприцев. Поскольку пластик создает сильный фоновый сигнал при контакте с хлороформом, начните экстракцию липидов, добавив к клеточной суспензии шесть миллилитров смеси хлороформа и метанола в соотношении 1:2 и 0,8 миллилитра стеклянных шариков, отмеренных в пробирке типа Эппендорф. Точные объемы не являются критическими, если соблюдается соотношение 1:2:0,8 для хлороформа, метанола и дрожжей, суспендированных в воде. Перемешайте на вортексе.

Суспензию клеток и стеклянные шарики перемешивают дважды по одной минуте, затем добавляют два миллилитра хлороформа, осторожно перемешивают и инкубируют в течение пяти минут при комнатной температуре, периодически перемешивая. После пятиминутной инкубации добавляют два миллилитра дистиллированной воды и осторожно перемешивают. Затем снова инкубируют в течение пяти минут при комнатной температуре, периодически перемешивая.

Здесь также важнее соблюдать соотношение хлороформа, метанола и воды как 2:2:1.8, чем использовать конкретный объем. По завершении второй инкубации центрифугируйте пробу в течение пяти минут при 3000 Gs при комнатной температуре, перенесите весь супернатант после этой первой экстракции в новую стеклянную центрифужную пробирку для высокоскоростного центрифугирования и добавьте 3.2 milliliters хлороформа к оставшемуся осадку клеток для проведения второй экстракции липидов.

Дважды перемешайте осадок клеток с добавленным хлороформом на вортексе по одной минуте каждый раз. Затем центрифугируйте в течение пяти минут при 3000 Gs. При комнатной температуре добавьте супернатант из этой второй экстракции к супернатанту, собранному после первой экстракции. Затем центрифугируйте собранные супернатанты в течение пяти минут.

После центрифугирования при 3000 Gs при комнатной температуре экстрагированные липиды переходят в нижнюю органическую фазу. Удалите верхнюю водную фазу и перенесите нижнюю фазу в новую стеклянную центрифужную пробирку для высокоскоростного центрифугирования. Для получения более чистых спектров на масс-спектрометре центрифугируйте органическую фазу в течение пяти минут при 3000 Gs при комнатной температуре, после чего перенесите весь супернатант в стеклянный флакон.

Высушите растворенные липиды в потоке азота, растворите полученную липидную пленку в 500 µL хлороформа и храните при температуре -20 °C до начала анализа образцов методом масс-спектрометрии. Начните с приготовления стандартной смеси липидов в хлороформе согласно списку, приведенному в таблице 1 прилагаемого письменного протокола. Каждый липид представляет отдельный класс.

Данный раствор можно хранить при температуре минус 20 °C для последующего использования перед вводом экстрагированных липидов в масс-спектрометр. Смешайте 10 µL образца с 10 µL стандартной смеси липидов. Обратите внимание, что соотношение стандарта к образцу может быть изменено по мере необходимости.

Проведите разделение смеси липидов образца и стандарта с помощью масс-спектрометра Q ToF с микромассовым анализатором, оснащенного источником наноэлектроспрея, работающим при скорости потока 1 µL/min. Параметры настройки подробно описаны в таблице 2 прилагаемого письменного протокола. Несмотря на то, что использование высокого разрешения масс-спектрометра Q ToF является преимуществом, это не является обязательным требованием.

Точные параметры приборов будут различаться в зависимости от модели масс-спектрометра. После сбора данных выполняется сглаживание масс-спектров, вычитание фона и центрирование пиков. В завершение экспортируйте список пиков в excel.

Затем нормализуйте пики каждого липидного стекла по внутреннему стандарту. В зависимости от целей применения может потребоваться дополнительная постобработка, такая как удаление изотопов и деконволюция. Данный метод позволяет проводить экспресс-анализ основных компонентов липидного профиля дрожжей.

Здесь мы выделили один липид, для которого была проведена деконволюция изотопных пиков и нормализация относительно внутреннего стандарта. Мы только что продемонстрировали вам способ выделения липидов дрожжей и метод их определения с помощью масс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости избегать использования пластика и следить за тем, чтобы концентрация вашего образца находилась в линейном диапазоне.

Этот метод достаточно гибкий, и объемы многих реагентов могут быть изменены по мере необходимости. Данный протокол экстракции также подходит для других методов анализа липидов, таких как тонкослойная хроматография и многомерная масс-спектрометрия. На этом всё.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.