Количественная оценка Белки Использование пептидов обогащению иммуноаффинной В сочетании с масс-спектрометрии
31 июля 2011 г.
Стабильный Стандарты Изотопные и Capture Анти-пептидов Антитела (SISCAPA) пары близость обогащение пептиды со стабильной изотопного разбавления масс-спектрометрии (MRM-MS) для обеспечения количественного определения пептидов в качестве суррогатов для соответствующих белков. Здесь мы опишем протокол с использованием магнитных частиц в частично автоматизированные формате.
Общая цель следующей процедуры заключается в выделении и количественном определении пептидов в сложной смеси, которые выступают в качестве суррогатов соответствующих белков. Сначала крупные белки в составе смеси переваривают до компонентных пептидов с использованием такого фермента, как трипсин. Затем целевые пептидные аналиты и добавленный внутренний стандарт, меченный стабильными изотопами, обогащают с помощью антипептидных антител, иммобилизованных на магнитных частицах с белком G, после проведения изоляции.
Целевые пептиды элюируют с магнитных частиц и анализируют методом масс-спектрометрии для количественного определения относительно внутреннего стандарта. Основным преимуществом данного метода перед существующими, такими как традиционный иммуноанализ, является то, что он быстрее и экономически эффективнее при создании большого количества анализов. Метод характеризуется высокой эффективностью и легко поддается мультиплексированию, что и будет продемонстрировано в описанной процедуре.
Лаборант взял 10 µL плазмы крови на лед. Перенесите образец в планшет с глубокими лунками объемом 1000 µL и накройте парафиленовой пленкой для денатурации белков. Добавьте по 20 µL свежего 9 M раствора мочевины и 30 mM DTT в каждый образец и инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C. Добавьте по 3 µL свежего 500 mM иодацетамида в каждый образец и инкубируйте в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре. Теперь разбавьте мочевину до 0,6 M с помощью 100 mM Tris pH 8 и добавьте 10 µL стокового раствора трипсина в концентрации 1 µg/µL для достижения соотношения фермента к субстрату 1:50.
После инкубации реакционной смеси при 37 °C в течение ночи с добавлением 3 µL чистой муравьиной кислоты до конечной концентрации 1% приступайте к добавлению стандарта с изотопно-мечеными соединениями или нескольких таких стандартов. При проведении мультиплексного анализа тщательно промойте планшет с картриджами Oasis 500 µL 0,1% муравьиной кислоты в 80% ацетонитриле, слив фильтрат. Затем уравновесьте планшет с картриджами, добавив 500 µL 0,1% муравьиной кислоты в воде, и слейте фильтрат.
Загрузите образцы гидролизата на картриджную пластину и отрегулируйте вакуум так, чтобы поток был очень медленным. Трижды промойте образцы 500 µL 0,1% муравьиной кислоты в воде и удалите фильтрат. Элюируйте пептиды дважды, используя 500 µL 0,1% муравьиной кислоты в 80% ацетонитриле, затем лиофилизируйте или высушите элюат в вакуум-центрифуге досуха и восстановите высушенные пептиды в 50 µL PBS с добавлением 0,03% Chaps. Перенесите образцы в стандартный 96-луночный планшет Kingfisher; добавьте 1 µg антитела и 1,5 µL магнитных частиц, покрытых белком G, на каждую мишень. Перед добавлением перемешайте частицы на вортексе.
Чтобы обеспечить равномерную суспензию бусин, накройте планшет фольгой и инкубируйте его в течение ночи в ротаторе. Центрифугируйте планшет при 400 RPM в течение 10 секунд, чтобы удалить жидкость с поверхности фольги.
Снимите фольгированную крышку. Манипуляции с образцами проводятся на автоматизированной платформе Kingfisher. Дважды промойте гранулы 200 µL PBS с добавлением 0,03% CHAPS, а затем один раз 200 µL разведенного в 10 раз раствора PBS с 0,03% CHAPS. Теперь элюируйте пептиды, используя 25 µL 5% уксусной кислоты с добавлением 0,03% CHAPS.
Поместите элюционную планшетку на магнит и перенесите элюат в 96-луночный планшет, стараясь не переносить остатки бусин. Накройте планшет герметичной крышкой и передайте этот планшет с элюатом в тройной или четверной масс-спектрометр для анализа. Метод MRM разрабатывается путем получения тандемного масс-спектра интересующего пептида с последующим выбором и оптимизацией наиболее подходящих фрагментных ионов перехода.
Обычно для MRM-анализа используется ловушка C 18 и аналитическая колонка с двумя подвижными фазами. Введите 10 µL образца и проведите элюирование с использованием линейного градиента. Интегрируйте площади пиков легких и тяжелых пептидов, а затем рассчитайте отношение площадей пиков немеченого и меченого пептидов для каждого образца.
Легкие и тяжелые пептиды элюируются одновременно, и для каждого пептида можно отслеживать несколько переходов. Для подтверждения идентичности площадь пика эндогенного пептида измеряется относительно площади внутреннего стандарта, что позволяет получить количественную оценку целевого пептида. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как реализовать этот метод в вашей лаборатории. Его можно использовать для количественного определения любого интересующего белка, что делает его подходящим для широкого спектра применений в биологических исследованиях.
Обзор
В данной статье описывается метод использования стандартов стабильных изотопов и захвата антителами к пептидам (SISCAPA), который сочетает в себе аффинное обогащение пептидов с масс-спектрометрией с разбавлением стабильными изотопами для количественного определения пептидов. В протоколе используются магнитные частицы в частично автоматизированном формате для повышения эффективности.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биохимия
- Масс-спектрометрия
Теоретическая часть
- Метод SISCAPA позволяет осуществлять количественное определение пептидов в качестве суррогатов белков.
- Данный метод превосходит традиционные иммуноанализы по скорости и экономической эффективности.
- Он подходит для мультиплексных анализов, позволяя одновременно анализировать несколько пептидов.
- Метод заключается в расщеплении белков до пептидов и их обогащении с использованием специфических антител.
Цель исследования
- Выделение и количественное определение пептидов из сложных смесей.
- Демонстрация протокола, повышающего эффективность анализа пептидов.
- Предоставление метода, который может широко применяться в биологических исследованиях.
Используемые методы
- Расщепление белков трипсином для получения пептидов.
- Обогащение целевых пептидов с помощью антипептидных антител на магнитных частицах.
- Масс-спектрометрический анализ для количественного определения пептидов.
- Внедрение частично автоматизированного рабочего процесса с использованием платформы KingFisher.
Основные результаты
- Метод SISCAPA обеспечивает высокий уровень успешности количественного определения пептидов.
- Он демонстрирует возможность эффективного проведения мультиплексных анализов.
- Количественные измерения достигаются путем сравнения соотношений легких и тяжелых пептидов.
- Данный метод может быть адаптирован для различных целевых белков.
Выводы
- SISCAPA представляет собой надежный метод количественного определения пептидов в биологических образцах.
- Данный протокол может быть внедрен в лабораториях для различных целей применения.
- Метод обладает преимуществами перед традиционными подходами, что делает его ценным инструментом в исследованиях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Количественное определение белков остается критическим узким местом в валидации мишеней и поиске биомаркеров, поскольку традиционные иммуноанализы сталкиваются с ограничениями по стоимости, времени выполнения и интерференции. Метод SISCAPA представляет собой масштабируемую и мультиплексную альтернативу, которая повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска, обеспечивая стехиометрическое, не зависящее от антител количественное определение протеотипических пептидов. Это способствует принятию обоснованных по рискам решений по портфелю проектов и обеспечивает трансляционную преемственность от гипотезы к доклиническим моделям.
Стратегическое применение в исследованиях и разработках биофармацевтики
Ранние этапы поиска и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем точного количественного определения целевых белков в сложных матрицах.
- Практическая ценность: снижает неопределенность механизмов за счет использования протеотипических пептидов в качестве стехиометрических суррогатов концентрации белка.
- Прогностическая ценность: способствует сортировке портфеля за счет предоставления воспроизводимых мультиплексных данных для приоритизации мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Создание валидированных рабочих процессов обогащения пептидов, совместимых с последующим количественным определением методом SRM/MRM-MS.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизации и воспроизводимости анализа за счет использования внутренних стандартов на основе стабильных изотопов и обогащения с помощью магнитных частиц.
- Масштабируемость: Облегчение разработки мультиплексных анализов для параллельной оценки нескольких мишеней без истощения плазмы.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Связывает этапы открытия и доклинических исследований, обеспечивая количественное определение пептидов, применимое для различных типов образцов.
- Снижение механистических рисков: Обеспечивает согласованность биомаркеров за счет специфического обнаружения пептидов, устойчивого к интерференции, в системах, релевантных для заболевания.
- Прогностическая достоверность: Поддерживает принятие решений о продвижении проекта с учетом рисков посредством количественного измерения белков без использования антител.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Метод SISCAPA интегрируется в процесс поиска лекарственных средств — от валидации мишени до идентификации ведущих соединений, обеспечивая количественное измерение белков в качестве основы для разработки анализов и проведения скрининговых кампаний.
- Открытия в биологии: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей путем количественного определения целевых белков в естественных биологических контекстах.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет воспроизводимого обогащения пептидов и количественных данных масс-спектрометрии (MS) для оценки соединений.
- Аналитика: предоставляет соотношения площадей пиков легких и тяжелых пептидов в качестве количественных показателей для сравнения экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации за счет стандартизированного количественного определения пептидов.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как многократностью используемая платформа для мультиплексного количественного определения мишеней в различных проектах и терапевтических областях.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Прогностическая достоверность, валидация мишеней, устранение неопределенности механизмов действия.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость.
- Стратегическая ценность: Более обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: Приоритизация и принятие решений о дальнейшем продвижении с учетом скорректированных рисков.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области протеомики, обогащения с помощью антител и масс-спектрометрии.
- Зависит от доступа к масс-спектрометрам с возможностью SRM/MRM и платформам для работы с магнитными частицами.
- Необходима межкомандная стандартизация критериев валидации антител и выбора пептидов.
- Требуется учет особенностей адаптации для различных типов образцов, включая плазму, клеточные лизаты и экстракты тканей.
- Существуют практические ограничения, связанные с доступностью антител к конкретным пептидам и эффективностью трипсинового переваривания.
