Прямое возобновление репликации Форк блокировалось Головой об РНК-полимеразы

Общая цель данной процедуры заключается в наблюдении за судьбой зоны репликации и РНК-полимеразы (RNAP) после лобового столкновения. Это достигается путем первоначальной сборки транскрипционного комплекса на биотинилированной ДНК и его иммобилизации на таблетках и гранулах Stripp, что приведет к образованию остановленного комплекса элонгации RNAP. Вторым этапом процедуры является лигирование предварительно подготовленной разветвленной ДНК к комплексу элонгации RNAP для формирования репликационной вилки ниже по течению от лобового RNAP.

Третьим этапом процедуры является сборка репликационной зоны и инициирование синтеза лидирующей цепи в репликационной вилке. Заключительным этапом процедуры является выделение ДНК с магнитных частиц и очистка ДНК с помощью колонки для очистки продуктов ПЦР. В конечном итоге, с помощью щелочного агарозного геля очищенных радиоактивно меченных продуктов ДНК, можно получить результаты, демонстрирующие остановку реплисомы при лобовом столкновении с транскрипционным комплексом.

Здравствуйте, я Ричард Померанс из лаборатории Майка О'Доннелла в Университете Рокфеллера. Сегодня я продемонстрирую вам процедуру проведения лобового столкновения рибосомы с РНК-полимеразой в твердой фазе. В нашей лаборатории мы используем этот метод для изучения того, как на процесс репликации влияют транскрипционные комплексы, расположенные вдоль ДНК.

Итак, приступим. Для начала данного протокола смешайте голофермент РНП в 100 мкл буфера А с биотинилированной матрицей ДНК размером 3,6 KB, содержащей промотор T7 A1; инкубируйте смесь в течение 10 минут при 37 °C. После 10-минутной инкубации добавьте рибонуклеотиды аденозинтрифосфат, цитидинфосфат и уридин, что ограничит синтез РНК до 20 нуклеотидов.

Инкубируйте раствор еще в течение 10 минут при 37 °C для иммобилизации остановленного комплекса элонгации RNase P на гранулах. Добавьте раствор к магнитным гранулам, покрытым стрептавидином. Инкубируйте смесь в течение 10 минут при комнатной температуре.

Очистите иммобилизованный комплекс остановленной элонгации РН-А-П, промыв гранулы 0,9 миллилитрами буфера с высоким содержанием соли. Чтобы удалить неспецифические комплексы Р-Н-А-П-Д-Н-К после каждой промывки, удалите супернатант с помощью магнитной сепарации. Эту процедуру промывки следует повторить пять раз.

Затем бусины следует промыть еще дважды 0,9 мл буфера A. После финальной промывки можно собрать нижележащую репликационную вилку, чтобы сформировать репликационную вилку ниже по течению от RNAP в режиме head-On. Ресуспендируйте магнитную полоску с бусинами, прикрепленными к остановленному комплексу элонгации RNAP, в 100 мкл буфера 4 от New England Biolabs. Затем добавьте 10 единиц щелочной фосфатазы из креветок (SAP) и инкубируйте образец в течение 10 минут при 37 °C. Промойте бусины трижды 0,9 мл буфера A. Затем ресуспендируйте бусины в 50 мкл буфера для реакции быстрой лигирования T4.

Добавьте 2 µL T4 лигазы быстрого действия и предварительно подготовленную раздвоенную ДНК, затем инкубируйте раствор в течение 10 минут при комнатной температуре. В завершение трижды промойте гранулы 0,9 мл буфера A; смешайте гексамер, ДНК-хеликазу с магнитными стрептавидин-гранулами, которые прикреплены к остановленному комплексу элонгации РНП и нижележащей репликационной вилке. Приготовьте раствор в 150 µL буфера A и инкубируйте его в течение 30 секунд при 23 °C.

После короткой 32-й инкубации при 23 °C добавьте к полимеразе III бета-зажиму ATP, DGTP, dATP, alpha P 32-меченный DGTP и alpha P 32-меченный dATP до достижения общего объема 200 µL. Инкубируйте образец в течение пяти минут при 37 °C.

Запустите репликацию, добавив одноцепочечный ДНК-связывающий белок, DCTP и DTTP. Также добавьте меченые α-P³² DTTP и DCTP до конечного объема 250 microliters. Через 10 минут остановите реакции, добавив 12 microliters 0.5 molar EDTA.

Затем прокипятите бусины со стрэптавидином, чтобы высвободить ДНК из бусин. Удалите остаточную ДНК, обработав бусины протеиназой K в течение 30 минут при 50 °C. Снова прокипятите бусины и удалите супернатант с помощью магнитной сепарации.

Очистите объединенный супернатант, содержащий ДНК, с помощью набора для очистки продуктов ПЦР Kyogen. В завершение проанализируйте очищенные радиоактивно меченные продукты ДНК в щелочном агарозном геле. Столкновение зоны с идущей навстречу РН-полимеразой обычно приводит к образованию двух продуктов длиной 2.5 KB и 3.6 KB. Продукт длиной 2.5 KB соответствует длине ДНК от вилки до остановленной РН-полимеразы.

Это происходит из-за остановки репликативной вилки при столкновении с РНП. Продукт размером 3,6 KB представляет собой полноразмерную ДНК и образуется либо вследствие неполной оккупации промотора РНП, либо частичного прохождения репликативной вилки через РНП при лобовом столкновении. Хорошим результатом считается получение примерно 50% полноразмерной ДНК.

Однако в некоторых случаях наблюдается меньшая степень заполнения промотора РНК-полимеразой (RNAP), что приводит к большему проценту полноразмерной ДНК. Это объясняется тем, что при отсутствии заблокированной RNAP большая часть зон репликации не сталкивается с РНК-полимеразой, движущейся навстречу, в результате чего образуется только полноразмерная ДНК. Мы только что продемонстрировали, как проводить репликацию на твердой фазе в присутствии заблокированного комплекса элонгации РНК-полимеразы, связанного с ДНК. При выполнении данной процедуры важно промыть заблокированный комплекс транскрипции раствором с высокой концентрацией соли, чтобы удалить избыток РНК-полимеразы, которая неспецифически связывается с ДНК и ингибирует репликацию.

На этом все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.