Совместное выражение несколько химерных флуоресцентные синтез белков в эффективным способом в растениях
1 июля 2018 г.
Мы разработали новый метод для совместного выражения несколько химерных флуоресцентные синтез белков в растения преодолевать трудности обычных методов. Он принимает преимущество использования плазмида одного выражения, содержащего несколько функционально независимой белка, выражая кассет для достижения совместного выражения протеина.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области молекулярной и клеточной биологии растений, например, как мы можем использовать белки в клетке. Основным преимуществом данной методики является высокая эффективность коэкспрессии клеточных гибридных белков в одном векторе экспрессии. Демонстрировать процедуру будет Гуитао Чжун, аспирант нашей лаборатории.
Для начала разработайте праймеры для молекулярного клонирования фрагментов ДНК, как описано в текстовом протоколе. Амплифицируйте фрагменты ДНК, необходимые для построения полунезависимых кассет экспрессии белков, с помощью стандартных реакций ПЦР с соответствующими праймерами и высокоточной полимеразой. К ним относятся промотор, флуоресцентный репортер, ген-мишень и терминатор.
Проверьте качество продуктов первого раунда ПЦР путем поиска деградации и загрязнения ДНК с помощью электрофореза ДНК с использованием 1%-ного агарозного геля. Количественное определение продуктов ПЦР с помощью спектрофотометра. Соотношение между показаниями на 260 и 280 нанометрах продуктов ПЦР должно составлять от 1,6 до 1,8.
Смешайте фрагменты ДНК, предназначенные для одной и той же кассеты экспрессии белка, в одной ПЦР-пробирке до конечного объема в пять микролитров. О смешивании DNS из разных данных кассеты с выражениями. Поскольку равенство снижает эффективность сборки ДНК из-за увеличения количества молекул ДНК, которые должны быть связаны.
Теперь добавьте 15 микролитров смеси 2x master к смеси ДНК объемом 5 микролитров и инкубируйте при температуре 50 градусов Цельсия в течение 60 минут. Амплифицируйте всю полунезависимую кассету экспрессии белка с помощью второго раунда ПЦР. Используйте от 0,5 до одного микролитра продукта из реакции изотермической сборки первого раунда в качестве шаблона в самых внешних грунтовках.
Используйте одну единицу высокоточной полимеразы в реакционном объеме 50 микролитров в течение 30 циклов, после чего окончательно удлинейте при температуре 68 градусов Цельсия в течение пяти минут. Затем линеаризуют основной вектор окончательной экспрессии белка POC 18 и вектор CAMBIA 1300, добавив четыре единицы малой единицы в итоговый реакционный объем объемом 10 микролитров. Эти векторы предназначены для транзиторной экспрессии белков и генетической трансформации.
Инкубируйте рестрикционный дайджест в течение одного-двух часов при температуре 25 градусов Цельсия. После пищеварения инактивируйте фермент рестрикции, инкубируя при температуре 65 градусов Цельсия в течение 20 минут. Затем смешайте эквимолярные молекулы ДНК из кассет экспрессии белка и линеаризованный конечный вектор в конечный объем реакции в пять микролитров.
Наконец, проведите второй раунд рекомбинации ДНК, смешав реакцию с 15 микролитрами 2x мастер-буфера и инкубируя при температуре 50 градусов Цельсия в течение 60 минут. Для подготовки суспензионных клеток табака BY-2 к бомбардировке необходимо с помощью вакуумного насоса собрать 30 миллилитров 3-дневных культивируемых клеток BY-2 на листе автоклавной фильтровальной бумаги объемом 70 миллилитров, установив вакуумное давление на 40 миллибар. Тем временем добавьте несколько капель жидкой питательной среды BY-2 в чашку Петри.
Переложите фильтровальную бумагу с находящимися на ней ячейками BY-2 в чашку Петри. Чтобы подготовить молодые растения арабидопсиса к бомбардировке, подготовьте семидневные образцы растений, как подробно описано в текстовом протоколе. Затем перенесите их в прямоугольник в центре новой половинчатой средней пластины MS для повышения эффективности бомбардировки.
Следите за тем, чтобы растения не перекрывались при переносе и размещении их на тарелке. Добавьте несколько капель жидкой среды МС половинной концентрации на поверхность растений или тканей, чтобы сохранить влагу и предотвратить высыхание растений во время оставшихся этапов. Чтобы покрыть частицы золота плазмидной ДНК, сначала тщательно окунитесь в раствор золотого микроносителя в течение трех минут.
Теперь добавьте 25 микролитров частиц золота в новую 1,5-миллилитровую пробирку и делайте вихрь в течение 10 секунд. Добавьте 10 микролитров 25,46 миллиграмм на литр спермидина и вортекс на 10 секунд. Далее добавьте пять микролитров по одному микрограмму на микролитр плазмидной ДНК, и вортексируйте в течение трех минут.
Наконец, добавьте 25 микролитров 277,5 миллиграммов на литр раствора хлорида кальция и вортексируйте в течение одной минуты. Раскрутите золотые микроносители с помощью настольной центрифуги на максимальной скорости в течение пяти секунд. После центрифугирования осторожно выведите надосадочную жидкость, не потревожив гранулу.
Затем промойте гранулу 200 микролитрами абсолютного этанола и повторно суспендируйте гранулу путем вортексирования в течение пяти-10 секунд. Как только вы наберете, раскрутите золотые микроносители на максимальной скорости в течение пяти секунд и удалите этанол. Повторно суспендируйте частицы золота в 18 микролитрах абсолютного этанола.
Затем нанесите шесть микролитров суспензии частиц на середину трех микроносителей и дайте им высохнуть на воздухе. Чтобы перенести ДНК в клетки и растения с помощью бомбардировки частицами, сначала настройте систему доставки частиц, как описано в текстовом протоколе. Затем трижды бомбардируйте клетки или растения на агросредней пластине в трех разных положениях.
Держите подвергшиеся бомбардировке клетки и растения в темноте в камере для роста растений от шести до 72 часов до начала наблюдения флуоресцентных сигналов. Установите камеру роста растений на 24 часа темноты и 22 градуса по Цельсию. Перенесите молодые растения или суспензионные клетки на обычное предметное стекло и аккуратно положите сверху предметное стекло для визуализации с помощью стандартной конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
Используя настройки, перечисленные в текстовом протоколе, возбуждать белки, помеченные GFP, на 485 нанометрах и обнаруживать флуоресценцию на 525 нанометрах. Для белков, помеченных RFP, возбуждайте на 585 нанометрах и детектируйте на 608 нанометрах. Наконец, рассчитайте коэффициент коллокализации флуоресцентных сигналов, как описано в текстовом протоколе.
Коэкспрессия arabidopsis VSR-2 и arabidopsis SCAMP4 в клетках табака BY-2 была достигнута путем бомбардировки частицами и показала правильную локализацию. RFP arabidopsis VSR-2 демонстрирует точечный рисунок, который отличался от локализации на плазматической мембране arabidopsis SCAMP4-GFP, с некоторыми цитозольными пунктированными точками. Кроме того, трансгенные растения arabidopsis, которые совместно экспрессируют arabidopsis SCAMP4-GFP и RFP arabidopsis VSR-2, были получены путем трансформации, опосредованной агробактериями.
Показана субклеточная локализация коэкспрессии двух химерных белков в корневых и корневых волосковых клетках. В соответствии с предыдущими исследованиями, лечение трансгенного арабидопсиса вызывало RFP arabidopsis VSR-2, меченные превакуалярными компартментами, образуя небольшую кольцеобразную структуру. В то время как лечение префолдином А индуцированным арабидопсисом SCAMP GFP мечено агрегацией G-сети transgold.
В качестве отрицательного контроля наблюдается слабый аутофлуоресцентный сигнал в клетках табака BY-2 и клетках корня и волосковых клеток арабидопсиса при применении тех же настроек сбора изображений. Этот метод может дать представление о субклеточной локализации белков. Он также может быть применен для изучения белка в направлении.
После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биологии растительных клеток. Для удобного экспорта субклеточные локализации и пространственное взаимодействие белков в живой растительной клетке. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как ПЭТ-опосредованная трансформация и генетическое скрещивание, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как совместно экспрессировать несколько гибридных белков в растениях.
Не забывайте, что работа с бомбардировкой может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как защита глаз.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен новый метод коэкспрессии нескольких химерных флуоресцентных слитных белков в растениях. В данной методике используется одна экспрессионная плазмида, содержащая несколько независимых кассет экспрессии белков, что повышает эффективность коэкспрессии белков.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Молекулярная биология растений
- Клеточная биология
- Белковая инженерия
Теоретическая часть
- Традиционные методы коэкспрессии белков в растениях часто имеют ряд ограничений.
- Химерные флуоресцентные слитые белки представляют большую ценность для изучения клеточных процессов.
- Эффективная коэкспрессия может облегчить проведение сложных биологических исследований.
- Данный метод направлен на оптимизацию процесса экспрессии белков в растительных системах.
Цель исследования
- Разработать более эффективный метод коэкспрессии белков в растениях.
- Преодолеть ограничения существующих методов экспрессии белков.
- Предоставить исследователям возможность более эффективно изучать взаимодействия и функции белков.
Используемые методы
- Разработка праймеров для молекулярного клонирования фрагментов ДНК.
- Амплификация фрагментов ДНК, необходимых для конструирования полунезависимых кассет экспрессии белков.
- Использование стандартных реакций ПЦР с высокоточной полимеразой.
- Включение в дизайн промоторов, флуоресцентных репортеров, целевых генов и терминаторов.
Основные результаты
- Метод демонстрирует высокую эффективность коэкспрессии клеточных слитых белков.
- Он позволяет использовать один экспрессионный вектор для нескольких белков.
- Результаты указывают на улучшение показателей в исследованиях экспрессии белков.
- Данный подход может значительно продвинуть исследования в области молекулярной биологии растений.
Выводы
- Новый метод представляет собой надежное решение для коэкспрессии белков в растениях.
- Он открывает новые возможности для исследования функций и взаимодействий белков.
- Данная методика может углубить понимание сложных биологических процессов в растениях.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Эффективная коэкспрессия нескольких флуоресцентных слитых белков в растениях позволяет проводить точные исследования пространственно-временной локализации, что крайне важно для валидации мишеней в биофармацевтических исследованиях на растительной основе. Данный метод снижает механистическую неопределенность, позволяя проводить прямое сравнение с маркерами органелл, что повышает прогностическую достоверность функциональных анализов. Он решает ключевую проблему этапа поиска при фенотипическом скрининге, когда эффективность коэкспрессии влияет на надежность данных и производительность анализа.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы посредством одновременной визуализации локализации нескольких белков в живых клетках растений.
- Операционная ценность: снижает вариативность уровней экспрессии и временные затраты за счет устранения необходимости в использовании множества плазмид и генетического скрещивания.
- Стратегическая ценность: способствует снижению биологических рисков, предоставляя воспроизводимые данные о субклеточной локализации для приоритезации мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает получение количественных данных о колокализации, необходимых для стандартизации анализа в исследованиях белковых взаимодействий.
- Операционная ценность: облегчает подготовку валидированных биологических систем, совместимых с методами FRET и BiFC, для последующего скрининга.
- Стратегическая ценность: повышает готовность к скринингу и возможность повторного использования платформы благодаря одновекторной системе, масштабируемой для различных модельных систем.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: обеспечивает непрерывность работы системы, имеющей значение для исследования заболевания, путем подтверждения коэкспрессии как в транзиентных, так и в стабильных трансгенных системах растений.
- Практическая ценность: позволяет принимать обоснованные решения о дальнейшем развитии проекта с учетом рисков благодаря получению согласованных, воспроизводимых данных о локализации белков в различных экспериментальных моделях.
- Стратегическая ценность: способствует согласованию трансляционных биомаркеров путем подтверждения ожидаемых паттернов субклеточной локализации перед началом инвестиций в доклинические исследования.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в континуум поиска новых лекарственных средств — от валидации мишени до идентификации соединений-лидеров, предоставляя достоверные данные о субклеточной локализации, что позволяет снизить риски при изучении механизмов действия.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей посредством прямой визуализации химерных флуоресцентных слитных белков in planta.
- Скрининг: Предоставляет готовые к анализу воспроизводимые системы экспрессии с количественными показателями флуоресценции для оценки эффекта соединений.
- Аналитика: Позволяет рассчитывать коэффициенты колокализации, что помогает исследователям сравнивать условия взаимодействия белков и оценивать связывание с мишенью.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность между фундаментальными открытиями и доклиническими исследованиями за счет валидированной коэкспрессии в трансгенных растениях, что способствует подтверждению биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: Служит многократно используемой платформой для кампаний по коэкспрессии нескольких белков, сокращая необходимость в избыточном конструировании векторов в различных проектах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозирования при валидации мишеней за счет минимизации механистической неопределенности в исследованиях локализации.
- Операционная ценность: Улучшает стандартизацию и масштабируемость благодаря коэкспрессии с помощью одного вектора, совместимой с существующими рабочими процессами биовизуализации.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала за счет сокращения числа неудачных анализов, вызванных плохой коэкспрессией, и обеспечения более быстрого принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go).
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию с учетом рисков, предоставляя надежные данные о субклеточной локализации, что снижает риски при продвижении мишени.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области молекулярного клонирования, оптимизации ПЦР и методов биобаллистики.
- Зависит от наличия высокоточной полимеразы, рестриктаз и конфокального микроскопа для детекции флуоресценции.
- Необходима стандартизация соотношений смешивания фрагментов ДНК для обеспечения эффективности сборки всех кассет.
- Требует учета особенностей адаптации для различных видов растений и типов клеток, включая суспензионные культуры клеток BY-2 и ткани Arabidopsis.
- Включает практические ограничения, связанные с протоколами биобезопасности при биобаллистике, а также необходимость инкубации в темноте после трансформации.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Title
0:38
DNA Fragment Assembly and Construction of Protein Expression Cassettes
2:03
Construction of the Vector for Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in Plants
3:30
Biolistic-bombardment Mediated Transient Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in Plants
7:20
Results: Representative Images of Co-expression of Chimeric Fluorescent Fusion of VSR and SCAMP in Plant Cells
8:40
Conclusion
